馬立亞,王東旭,龐真貞

(1.保定市第四中心醫(yī)院口腔科，河北保定 072350；2.保定市第一中心醫(yī)院口腔科，河北保定 071000)

口腔鱗癌(OSCC)屬于臨床常見的頭頸部惡性腫瘤。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在OSCC組織及細胞系中表達異常并可調(diào)控OSCC細胞增殖、遷移及侵襲等生物學行為[1-3]。 LncRNA LINC01224在肝癌中表達上調(diào)，沉默LINC01224表達可抑制肝癌進展[4]。有學者通過生物信息學分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-125b可能為LINC01224的靶基因，上調(diào)miR-125b表達可抑制乳腺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[5]。但LINC01224能否通過調(diào)控miR-125b的表達從而影響OSCC細胞增殖及凋亡過程尚未可知。因此，本研究通過檢測OSCC患者組織中LINC01224的表達水平并分析其對OSCC細胞增殖及凋亡的影響，探討LINC01224對miR-125b的靶向調(diào)控作用，旨在為揭示OSCC發(fā)生及發(fā)展的分子機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2017年2月至2018年3月保定市第四中心醫(yī)院口腔科收治的35例OSCC患者為研究對象，其中男25例，女10例，年齡(56.4±10.2)歲，均經(jīng)手術(shù)后病理組織學證實為OSCC。納入標準：患者未接受放療或化療等治療；臨床資料完整者。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者；合并其他基礎性疾病患者。于術(shù)中切除OSCC癌組織及癌旁組織，置于液氮中保存，術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批準文號：2017000152)，患者知情同意。

1.2主要儀器及試劑 口腔鱗癌細胞系CAL-27(美國ATCC細胞庫)。杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(美國Gibco公司)，胰蛋白酶、Lipofectamine 2000(美國Thermo Fisher公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒(北京天根生化科技公司)，LI NC01224小分子干擾RNA(si-LINC01224)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-125b寡核苷酸模擬物(miR-125b mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-125b特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-125b)及其陰性對照(anti-miR-NC)均購自廣州銳博生物科技公司，甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)均購自美國Sigma公司，膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒、RIPA裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量檢測試劑盒(北京全式金生物技術(shù)公司)，兔抗人半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3前體蛋白(pro-cysteinyl aspartate-specific protease-3，pro-caspase-3)、增殖標記蛋白細胞增殖核抗原67(antigen identified by monoclonal antibody，Ki67)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(clv-caspase-3)、兔抗人P21單克隆抗體(美國CST公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(武漢艾美捷科技公司)。 StepOnePlus實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Nanodrop2000c超微量分光光度計(北京眾力挽生物科技公司)，CytoFLEX流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)，CA-2000酶聯(lián)儀(上海掌動醫(yī)療科技公司)，DYCZ-24DN電泳儀(北京海天友誠科技公司)。

1.3方法

1.3.1細胞轉(zhuǎn)染及實驗分組 CAL-27細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d更換液1次。待細胞生長至80%融合度時，采用2.5 g/L胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×104/mL，按照每孔100 μL的細胞密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板，參照Lipofectamine 2000說明書分別將si-NC(20 μmol/L)、si-LINC01224(20 μmol/L)、si-LINC01224(20 μmol/L)與anti-miR-NC(20 μmol/L)、si-LINC01224(20 μmol/L)與anti-miR-125b(20 μmol/L)轉(zhuǎn)染至CAL-27細胞，設si-NC組(20 μmol/L)、si-LINC01224組(20 μmol/L)、si-LINC01224+anti-miR-NC組(si-LINC01224 20 μmol/L+anti-miR-NC 20 μmol/L)、si-LINC01224+anti-miR-125b組(si-LINC01224 20 μmol/L+anti-miR-125b 20 μmol/L)，轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集對數(shù)期細胞進行功能驗證。

1.3.2RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應 取出凍存的OSCC癌組織、癌旁組織及各組轉(zhuǎn)染后的CAL-27細胞，采用Trizol法提取組織及細胞中的總RNA，應用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度(濃度406.4 ng/μL，純度約為1.906)，置于-80 ℃保存。取2 ng RNA進行后續(xù)實驗，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃保存。

1.3.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測 根據(jù)GenBank中LINC01224及miR-125b基因的序列號(分別為GI:703491628、GI:440524748)，采用Primer Premier 5.0軟件設計引物，并送上海生工公司合成。LINC01224上游引物序列：5′-TGACACTTCTTGCCTGCAAC-3′，下游引物序列：5′-ACTTCTGCTTCCCGAGTTCA-3′，產(chǎn)物片段136 bp；miR-125b上游引物序列：5′-CCCTGAGACCCTAACTTGTGA-3′，下游引物序列：5′-GGTCTGTGTGTCTCCTCTGA-3′，產(chǎn)物片段152 bp；U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，產(chǎn)物片段255 bp；GAPDH上游引物序列：5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游引物序列：5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，產(chǎn)物片段325 bp。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應。PCR總反應體系為25 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL，10 μmol/L dNTPs 4 μL,10×PCR buffer 1 μL，模板DNA 2 μL，無菌ddH2O補足體積至25 μL。LINC01224以GAPDH為內(nèi)參，miR-125b以U6為內(nèi)參。反應參數(shù):95 ℃預變性3 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。于60 ℃時用StepOnePlus軟件采集熒光信號并進行熔解曲線分析，采用2-ΔΔCt法計算LINC01224、miR-125b相對表達水平。

1.3.4細胞周期檢測 收集各組對數(shù)期的CAL-27細胞，采用2.5 g/L胰蛋白酶消化，DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×106/mL，4 ℃、1 071×g離心5 min，加入預冷PBS洗滌后，500 μL預冷PBS重懸細胞，加入預冷70%乙醇3.5 mL，充分混勻，4 ℃溫育24 h。取出細胞懸液，4 ℃、9 990×g離心5 min，棄上清液，PBS洗滌，9 990×g離心5 min后棄上清液。向細胞沉淀中加入50 μL RNaseA，37 ℃溫育30 min，加入PI染色液450 μL，4 ℃溫育30 min，應用流式細胞儀檢測G1期、S期、M期細胞比例。

1.3.5MTT試驗檢測細胞增殖 收集各組對數(shù)期的CAL-27細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板(3×104個/孔)，每組設置3個復孔，轉(zhuǎn)染48 h時每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 ℃條件下經(jīng)1 300×g離心5 min，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，室溫避光振蕩溫育5 min。用酶聯(lián)儀檢測各孔吸光度值(A值)，計算細胞存活率，公式為：細胞存活率=(各實驗組A值-空白對照組A值)/(正常對照組A值-空白對照組A值)×100%。實驗重復3次。

1.3.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 收集各組對數(shù)期的CAL-27細胞，預冷PBS清洗，4 ℃、3 000×g離心5 min，棄上清液，加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，依次分別加入5 μL annexin V-FITC與5 μL PI染液，充分混勻，室溫避光溫育10 min，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。凋亡率=(早期凋亡細胞+晚期凋亡細胞)/細胞總數(shù)×100%。

1.3.7雙熒光素酶報告試驗檢測LINC01224的靶基因 采用StarBase軟件(http://starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php?source=mRNA)預測LINC01224與miR-125b存在結(jié)合位點，將含有結(jié)合位點及突變位點的序列片段分別插入熒光素酶報告基因載體構(gòu)建野生型載體WT-LINC01224、突變型載體MUT-LINC01224，將miR-NC、miR-125b mimics分別與WT-LINC01224、MUT-LINC01224共轉(zhuǎn)染至CAL-27細胞，轉(zhuǎn)染條件同1.3.1。置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞并檢測其熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性)。

1.3.8western blot檢測 收集各組對數(shù)期的CAL-27細胞(5×103個/孔)，加入400 μL RIPA裂解液提取細胞總蛋白質(zhì)。采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。將上述蛋白質(zhì)樣品按200 μg的總蛋白質(zhì)量進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(積層膠采用80 V電壓，分離膠采用100 V電壓)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜置于50 g/L脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入兔抗人pro-caspase-3、Ki67、clv-caspase-3、P21抗體(均1∶1 000稀釋)。 TBS/T洗膜3次，每次5 min，加入HRP標記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG二抗(1∶5 000稀釋)，37 ℃溫育l h。TBS/T洗膜5次后，曝光并采用Image J軟件對條帶進行灰度掃描及結(jié)果判讀。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1LINC01224在OSCC患者癌組織及癌旁組織中的表達 與癌旁組織比較，OSCC患者癌組織中LINC01224的表達水平(2.43±0.17 vs 1.00±0.05)顯著升高(t=98.345，P<0.05)，miR-125b的表達水平(0.98±0.06 vs 0.22±0.02)顯著降低(t=71.091，P<0.05)。

2.2抑制LINC01224對CAL-27細胞增殖的影響 與si-NC組比較，si-LINC01224組細胞存活率顯著降低(P<0.05)，G1期細胞比例顯著增加(P<0.05)，S期細胞比例顯著減少(P<0.05)；Ki67蛋白水平顯著降低(P<0.05)，P21蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 抑制LINC01224對CAL-27細胞增殖的影響

2.3抑制LINC01224對CAL-27細胞凋亡的影響 與si-NC組比較，si-LINC01224組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，clv-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 抑制LINC01224對CAL-27細胞凋亡的影響

2.4LINC01224靶向調(diào)控miR-125b StarBase軟件預測結(jié)果顯示LINC01224與miR-125b存在結(jié)合位點，共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-LINC01224的細胞試驗中，與miR-NC組(0.97±0.06)比較，miR-125b組熒光素酶活性(0.38±0.04)顯著降低(t=24.545，P<0.05)；共轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-LINC01224的細胞試驗中，miR-125b組熒光素酶活性(0.99±0.06)與miR-NC組(0.96±0.06)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與si-NC組(1.01±0.06)比較，si-LINC01224組細胞中miR-125b的表達水平(2.96±0.08)顯著升高(t=58.500，P<0.05)。

2.5抑制miR-125b可逆轉(zhuǎn)抑制LINC01224對CAL-27細胞增殖、凋亡的影響 與si-LINC01224+anti-miR-NC組比較，si-LINC01224+anti-miR-125b組細胞存活率顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，G1期細胞比例顯著減少(P<0.05)，S期細胞比例顯著增加(P<0.05)，pro-caspase-3、Ki67蛋白水平顯著升高(P<0.05)，clv-caspase-3、P21蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖3、表3、表4。

表3 抑制miR-125b可逆轉(zhuǎn)抑制LINC01224對CAL-27細胞增殖、凋亡的影響

表4 western blot檢測pro-caspase-3、clv-caspase-3、Ki67、P21蛋白的表達

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，LINC01224在乳腺癌中呈高表達并可作為評估乳腺癌患者預后的生物學標志物[6]。本研究結(jié)果顯示，LINC01224在OSCC組織中呈高表達，提示LINC01224在OSCC發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。我們還發(fā)現(xiàn)抑制LINC01224表達后OSCC細胞增殖能力顯著降低，細胞凋亡率顯著增高，提示抑制LINC01224表達可抑制OSCC細胞增殖，促進細胞凋亡。Ki67是腫瘤細胞增殖所需的DNA結(jié)合蛋白，其在腫瘤增殖各期均有表達；P21可負向調(diào)控細胞周期，抑制細胞增殖[7-8]。細胞凋亡過程與caspase級聯(lián)反應密切相關(guān)，caspase-3被激活后可誘導細胞凋亡[9]。本研究結(jié)果顯示，抑制LINC01224表達后G1期細胞比例顯著增加，S期細胞比例顯著減少，Ki67、pro-caspase-3表達下調(diào)，P21、clv-caspase-3表達上調(diào)，提示抑制LINC01224表達可能通過促進P21、clv-caspase-3表達及抑制Ki67、pro-caspase-3表達，從而抑制細胞增殖，誘導細胞周期阻滯及促進細胞凋亡。

為進一步探究LINC01224在OSCC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制，本研究通過雙熒光素酶報告試驗及qRT-PCR證實LINC01224可靶向結(jié)合miR-125b，并可負向調(diào)控miR-125b的表達。據(jù)報道，miR-125b在食管鱗癌組織及細胞系中表達下調(diào)，其表達水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，表達水平降低預示患者預后不良，并可能是影響患者預后的危險因素[10]。此外，miR-125b可抑制胰腺癌細胞遷移及侵襲[11]。另有報道顯示，miR-125b過表達可靶向抑制Bak1表達，從而抑制白血病細胞增殖及促進細胞凋亡[12]。上述研究提示miR-125b在腫瘤中可能發(fā)揮抑癌基因作用。本研究為驗證LINC01224是否通過調(diào)控miR-125b表達，從而影響OSCC細胞增殖及凋亡，進一步將si-LINC01224與anti-miR-125b共轉(zhuǎn)染至OSCC細胞，結(jié)果顯示其細胞增殖能力明顯增強，細胞凋亡率降低，pro-caspase-3、Ki67表達上調(diào)，clv-caspase-3、P21表達下調(diào)，提示LINC01224能抑制miR-125b的表達從而促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。

綜上所述，LINC01224在OSCC患者癌組織中呈高表達，通過體外細胞實驗證實,LINC01224可調(diào)控miR-125b表達,從而促進OSCC細胞增殖及抑制細胞凋亡，LINC01224是OSCC診斷及靶向治療的潛在靶點。但LINC01224/miR-125b調(diào)控下游靶基因表達的可能作用機制尚需進一步探究。