張政，鄭東，尹晶平，朱瓊芳，豐斌，梁玉婷，黃惠芳，邱駿

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床檢測(cè)中心，江蘇蘇州 215006)

結(jié)直腸癌是世界第三大常見(jiàn)惡性腫瘤，目前已證實(shí)多種因素與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。研究顯示，吸煙、飲酒、超重或肥胖、缺乏運(yùn)動(dòng)、蔬菜水果攝入量低、紅色肉類和加工肉類攝入量高等因素約占我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率的46%[2]。雖然TNM分期系統(tǒng)被臨床用于指導(dǎo)結(jié)直腸癌患者的治療和預(yù)后，但也存在一定的局限，例如，相同病理類型、TNM分期和治療方案的患者預(yù)后和結(jié)局可能完全不同[3]。因此，研究者開始關(guān)注于尋找預(yù)后分子標(biāo)志物，以指導(dǎo)結(jié)直腸癌的臨床決策。

CLDN23(claudin-23)基因是claudin基因家族的成員之一。Claudins蛋白家族是組成細(xì)胞間緊密連接必不可少的骨架蛋白，能維持細(xì)胞間的完整性，調(diào)節(jié)離子和分子的擴(kuò)散，并參與維持細(xì)胞極性和細(xì)胞間信號(hào)的傳遞[4-5]。研究指出，claudins蛋白的異常表達(dá)往往影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[6]。CLDN23基因被報(bào)道與胃癌[7]、胰腺癌[8]等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在關(guān)聯(lián)，表明CLDN23是一個(gè)潛在的腫瘤分子標(biāo)志物。本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法，綜合多種數(shù)據(jù)庫(kù)，探討CLDN23基因在結(jié)腸癌中的臨床和預(yù)后意義，旨為結(jié)腸癌提供新型預(yù)后分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1轉(zhuǎn)錄本測(cè)序數(shù)據(jù)的下載與處理 下載癌癥基因圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(TCGA)中結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄本測(cè)序數(shù)據(jù)。其中包括結(jié)腸癌組織樣本473例，正常組織對(duì)照41例。使用R 3.6.0軟件提取CLDN23基因在結(jié)腸癌組織和正常組織中的表達(dá)量，利用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較2組間的表達(dá)差異?；贑LDN23基因在結(jié)腸癌組織表達(dá)水平的中位值，將患者分為高、低表達(dá)2組。

1.2臨床數(shù)據(jù)的下載與處理 下載TCGA中結(jié)腸癌患者的臨床資料，刪除臨床資料缺失和生存時(shí)間為0的患者信息，提取患者的臨床特征(包括年齡、性別、T分期、N分期、M分期和病理Stage分期)。利用卡方檢驗(yàn)分析CLDN23基因表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.3CLDN23基因與結(jié)腸癌患者預(yù)后關(guān)系的分析 使用Log rank檢驗(yàn)分析高、低表達(dá)2組之間總體生存率的差異。使用單因素和多因素Cox回歸分析與結(jié)腸癌患者預(yù)后相關(guān)的臨床因素，探討CLDN23基因表達(dá)在結(jié)腸癌中的預(yù)后價(jià)值。

1.4GEPIA和OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)分析 使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證CLDN23基因在結(jié)腸癌中的表達(dá)以及與患者的預(yù)后關(guān)系。在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)界面中，設(shè)置條件如下：(1)Gene中輸入“CLDN23”；(2)Datasets Selection選擇COAD；(3)Matched Normal data選擇“Match TCGA normal data”； (4)Methods選擇Overall Survival和Disease Free Survival，其他條件選擇默認(rèn)。此外，OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)亦被用于驗(yàn)證分析CLDN23基因與結(jié)腸癌患者總體生存率的關(guān)系。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用 R 3.6.0 軟件和 IBM SPSS Statistics 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU檢驗(yàn))分析CLDN23基因在結(jié)腸癌組織和正常組織中的表達(dá)差異，使用卡方檢驗(yàn)分析CLDN23與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。生存分析使用Log rank檢驗(yàn)，單因素和多因素Cox回歸用于分析CLDN23基因在結(jié)腸癌中的預(yù)后作用。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CLDN23基因在結(jié)腸癌組織中顯著下調(diào)CLDN23基因在TCGA中的腫瘤表達(dá)情況見(jiàn)圖1A。在TCGA結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集中，共有41例正常組織，473例結(jié)腸癌組織。Mann-WhitneyU檢驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組織相比，CLDN23基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)下調(diào)(P<0.001)(圖1B)。刪除非配對(duì)的樣本，只保留41對(duì)癌組織和癌旁組織進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CLDN23基因在結(jié)腸癌組織中表達(dá)顯著降低(P<0.001)(圖1C)。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果也表明了CLDN23基因在結(jié)腸癌樣本中表達(dá)下調(diào)(圖1D、1E)。

2.2CLDN23基因與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 卡方檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，CLDN23與結(jié)腸癌患者的N分期顯著相關(guān)(P=0.046)。見(jiàn)表1。

表1 CLDN23基因與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析(n)

2.3CLDN23基因與結(jié)腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析 使用Log rank檢驗(yàn)分析高、低表達(dá)2組患者的總體生存率的差異，結(jié)果見(jiàn)圖2A。與高表達(dá)組相比，低表達(dá)CLDN23基因患者的總體生存率較差(P=0.018)。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，低表達(dá)CLDN23基因患者的總體生存率較差(P=0.04，圖2B)，但CLDN23基因表達(dá)與患者的無(wú)病生存期無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(P=0.88，圖2C)。OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明，低表達(dá)CLDN23基因的結(jié)腸癌患者的總體生存率不良(P=0.017，圖2D)。

2.4CLDN23基因可作為結(jié)腸癌的獨(dú)立預(yù)后因子 在TCGA結(jié)腸癌中，結(jié)合患者的臨床資料和生存數(shù)據(jù)，使用單因素和多因素Cox回歸分析CLDN23基因的預(yù)后作用。單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，年齡、病理分期、T分期、N分期、M分期均可以影響結(jié)腸癌患者的生存(P<0.05)；而多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，只有年齡(HR=1.04,95%CI:1.01～1.06,P=0.002)和CLDN23基因表達(dá)(HR=1.47,95%CI:1.09～1.96,P=0.01)可以作為結(jié)腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子，見(jiàn)表2。

表2 單因素和多因素Cox回歸分析

3 討論

研究表明，上皮細(xì)胞極性是影響癌癥起始和轉(zhuǎn)移形成的主要因素，上皮細(xì)胞極性的喪失可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和惡性轉(zhuǎn)化，在腫瘤發(fā)生的起始階段和腫瘤發(fā)展的后期具有重要作用[9]。上皮細(xì)胞的極性取決于包括緊密連接(tight junctions，TJs)和粘附連接的頂端連接復(fù)合體的建立[10]。緊密連接是這些細(xì)胞間連接中最頂端的，在維持細(xì)胞極性和調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通透性中起著至關(guān)重要的作用，它可以通過(guò)下調(diào)或上調(diào)緊密連接蛋白來(lái)改變緊密連接，從而觸發(fā)惡性轉(zhuǎn)化，致使癌癥進(jìn)展[11-12]。CLDNs(Claudins)是緊密連接的核心組件，對(duì)緊密連接的形成至關(guān)重要。CLDNs蛋白會(huì)形成細(xì)胞旁屏障，可以封閉上皮層，維持細(xì)胞極性以及控制離子和小分子在上皮細(xì)胞之間的流通，此外，這些蛋白質(zhì)還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞間信號(hào)如WNT/β-catenin、JAK-STAT3和Notch信號(hào)級(jí)聯(lián)等途徑[13-15]。

目前，有許多學(xué)者進(jìn)行了CLDNs基因/蛋白質(zhì)與結(jié)直腸癌的關(guān)系研究。Jiang等[16]研究表明，claudin-1的低表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良有關(guān)；通過(guò)促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的EMT可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移[17]。claudin-2基因被報(bào)道在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)調(diào)控YAP活性以及miR-222-3p的表達(dá)，可以促進(jìn)結(jié)直腸癌干細(xì)胞的自我更新[18]。下調(diào)的claudin-3可以通過(guò)IL-6/gp130/Stat3信號(hào)促進(jìn)結(jié)腸癌惡性腫瘤的發(fā)生[19]。claudin-4表達(dá)的嚴(yán)重缺失被證實(shí)與結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[20]。Wang等[21]研究指出，claudin-7蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，并通過(guò)EMT途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。claudin-11基因甲基化被報(bào)道與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移和不良生存有關(guān)[22]。此外，claudin-12[23]、claudin-18[24]等均被證明在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)異常，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。

本研究通過(guò)分析結(jié)腸癌數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，CLDN23基因在結(jié)腸癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，并且與患者的N分期相關(guān)。低表達(dá)的CLDN23基因與患者的總體生存率相關(guān)，且表達(dá)水平越低，患者的預(yù)后越差。多因素Cox回歸分析結(jié)果提示，CLDN23基因表達(dá)可以作為結(jié)腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，claudin-23在結(jié)直腸癌中的表達(dá)降低，可能是受到組蛋白甲基化酶EZH2的調(diào)控，導(dǎo)致claudin-23基因啟動(dòng)子高度甲基化，因而抑制其表達(dá), 且claudin-23可以明顯提升結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力，并與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[25]。雖然陳薇等[25]分析了claudin-23基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)，但該研究?jī)H采用了6對(duì)癌組織及相應(yīng)癌旁組織進(jìn)行分析，并且未探究claudin-23基因與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的聯(lián)系。Lu等[7]分析發(fā)現(xiàn)，在淺表性胃炎組織、萎縮性胃炎和胃癌組織中CLDN23基因表達(dá)水平逐漸降低，下調(diào)的CLDN23基因與腫瘤血管栓子的形成顯著相關(guān)。此外，CLDN23基因被指出可以作為腸型胃癌的候選抑癌基因[26]。孫宏治等[27]研究發(fā)現(xiàn)，CLDN23基因在倉(cāng)鼠胰腺癌組織中表達(dá)降低，并可以增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力，CLDN23基因的異常表達(dá)可能激活MEK信號(hào)通路。claudin-23還可能成為防止侵襲和轉(zhuǎn)移的分子治療的新靶點(diǎn)[8]。

綜上所述，CLDN23基因在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)，并與結(jié)腸癌惡性進(jìn)展相關(guān)，提示患者不良的生存結(jié)局。因此，CLDN23基因可作為結(jié)腸癌新型的預(yù)后分子標(biāo)志物，以指導(dǎo)結(jié)腸癌患者的臨床決策。