李景然，王朝紅，黃道奇，涂華玉，童克婷，葉登美，劉慧芳，朱健生

(安徽醫(yī)科大學附屬安徽省婦幼保健院遺傳醫(yī)學中心，合肥230000)

腦室增寬(ventriculomegaly，VM)是產(chǎn)前超聲檢查常見的胎兒畸形，與許多神經(jīng)疾病有關(guān)，如自閉癥、癲癇和不明原因的神經(jīng)發(fā)育遲緩等[1]。在妊娠15～40周時，側(cè)腦室的直徑保持相對穩(wěn)定，平均為5.4～7.6 mm,正常上限為10 mm，當單側(cè)或雙側(cè)腦室直徑在10～15 mm之間為輕度VM，直徑>15 mm為重度VM[2]。VM形成與染色體異常有關(guān)，當染色體異常時，可引起中腦膠質(zhì)增生、導水管狹窄及隔膜形成，從而導致VM[3]。核型分析是染色體異常篩查的金標準，可以顯示微小標記染色體(sSMC)數(shù)目和形態(tài)，但分辨率較低、周期長，且不能確定其來源[4]。染色體微陣列分析技術(shù)(CMA)具有高分辨率和全基因組的特點，可識別染色體數(shù)目異常和常規(guī)核型分析無法檢測出的微缺失和微重復，然而，CMA也有自身的局限性，如不能檢出倒位和平衡易位等。因此，本研究擬將CMA及核型分析相結(jié)合，有助于發(fā)現(xiàn)胎兒染色體核型和染色體亞顯微結(jié)構(gòu)的異常，從而為產(chǎn)前咨詢醫(yī)生提供胎兒預后評估的依據(jù)。

1 資料和方法

1.1研究對象 選擇2017年2月至2019年12月于我院超聲科行產(chǎn)前超聲檢查診斷為輕度VM的55例孕婦作為研究對象，年齡(29.96±5.20)歲，孕19～26周。納入標準[2]：單胎，產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒VM符合輕度VM診斷標準，伴或不伴其他超聲表現(xiàn)異常者。排除標準：多胎妊娠，胎兒腦積水，TORCH血清學檢查陽性，孕婦感染急性期，未進行隨訪的患者。本研究經(jīng)安徽省婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會批準[批準文號：2016(09)]，患者或家屬知情同意。

1.2試劑與儀器 吉姆薩染液(珠海貝索公司)，羊水培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，原位載玻片培養(yǎng)盒(杭州博圣公司)，QIAamp DNA Blood Mini Kit(德國Qiagen 公司)。Nanodrop 2000分光光度計、AffymetricCytoScan 750K Array分析平臺(美國Thermo Fisher Scientific公司)，CDS-5染色體分散儀(美國Thermotron公司)，GSL-120自動掃描儀和圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集及核型分析 孕婦于妊娠18～26周，由產(chǎn)前診斷中心抽取羊水24 mL，分為2管，258×g離心10 min，棄上清液，留取0.5 mL細胞懸液于原位載玻片培養(yǎng)盒中，加入羊水培養(yǎng)基3 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～8 d，加入秋水仙素80 μL(20 μg/mL)置培養(yǎng)箱25 min，低滲(加入1%檸檬酸鈉5 mL)室溫靜置25 min，預固定(5%冰乙酸固定7 min)，固定(甲醇∶冰乙酸=3∶1，固定10 min)，取出載玻片，用紗布吸取多余固定液，置入分散儀中，待玻片完全干燥，取出玻片，置于80 ℃烤箱烤片2 h，1.5 g/L胰蛋白酶消化14～18 s，吉姆薩染色12～15 min，晾干后上機，采用GSL-120自動掃描儀捕獲羊水核型。使用Leica cytovision核型分析軟件計數(shù)20個中期細胞核型，并分析5個核型，如有異常核型，增加計數(shù)量。

1.3.2樣本DNA提取 取孕婦羊水10 mL置于離心管中，580×g離心10 min，棄上清液。按照QIAamp DNA Blood Mini Kit說明書提取基因組DNA，Nanodrop 2000分光光度計檢測DNA濃度，取吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.0的樣本，置-20 ℃保存。

1.3.3CMA檢測 采用AffymetricCytoScan 750K Array分析平臺對羊水細胞DNA進行檢測，分析平臺主要設(shè)備包括AutoloaderDx2自動加載儀、GCS3000DX2芯片掃描儀、GCS3000Dx2 Workstation 工作站、FS450DX2 洗滌工作站、GCS3000Dx2 Workstation 工作站、Affymetrix?Chromosome、Analysis Suite(ChAS)2.0 分析軟件等。按照廠家標準操作。所得結(jié)果與國際基因組變異數(shù)據(jù)庫 the Database of Genomic Variants(http：//projects. ca/variation/cgi-bin/gbrowse/GRCh37)對比剔除常見的多態(tài)性拷貝數(shù)變異(CNVs)，其余CNVs與病理性CNVs數(shù)據(jù)庫(the Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources，http：//www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/)比較，基因相關(guān)的臨床信息經(jīng)在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM，www.ncbi. nlm.nih.gov/Omim/getmorbid.cgi)進行鑒定。最后使用PubMed數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)檢索相似或相同區(qū)段的 CNVs 相關(guān)文獻，綜合所得數(shù)據(jù)庫報道信息，判讀 CNVs 的臨床意義，按照美國醫(yī)學遺傳學與基因組學會指南[5]，將CNVs分為3大類5級：(1)致病性CNVs(pCNVs)；(2)良性CNVs；(3)臨床意義未明的CNVs(VOUS)；(4)可能致病性CNVs；(5)可能良性CNVs。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行。計數(shù)資料采用百分數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.155例VM中核型分析檢出的異常結(jié)果 55例輕度VM中核型分析檢出3例異常核型(分別為2例21-三體和1例4p缺失)，檢出率為5.5%(3/55)。

2.255例VM中CMA檢出的異常結(jié)果 經(jīng)CMA驗證，55例輕度VM中共檢出5例VOUS，檢出率9.1%(5/55)。進一步對病例1、2、3、5進行來源驗證，其中病例1、3、5來源于母親，病例2來源于父親。病例4未進行來源驗證，經(jīng)隨訪，嬰兒無明顯表型異常。病例6為Y染色體存在3.75 Mb重復，該重復為可能良性CNVs，經(jīng)CMA驗證該重復來源于父親。病例7為15號染色體存在1.74 Mb重復，該重復為可能致病性CNVs，經(jīng)CMA驗證該重復來源于母親。55例輕度VM中共檢出4例pCNVs，檢出率為7.3%。其中病例8為16號染色體存在1.7 Mb缺失，病例9為4號染色體存在26.19 Mb缺失，病例10、11為21-三體綜合征，以上4例pCNVs均可引起智力低下，發(fā)育遲緩等表型。見表1。

表1 10例腦室增寬胎兒染色體異常分析及妊娠結(jié)局

2.3核型分析與CMA檢測以及聯(lián)合檢測的檢出率比較 單獨使用核型分析的異常核型檢出率為5.5%(3/55)，單獨使用CMA對致病性CNVs的檢出率為7.3%(4/55)，兩者聯(lián)合對致病性CNVs的檢出率為7.3%(4/55)，與單項CMA及核型分析相比，差異無統(tǒng)計學意義(χ2分別為0.153、0.011，P>0.05)。

3 討論

由于不同類型的VM病因和預后不同，對胎兒VM的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷也不同。尤其是輕度至中度VM的胎兒預后變化很大，給產(chǎn)前咨詢醫(yī)生帶來一定困惑。因此，母嬰醫(yī)學會推薦：輕到中度VM胎兒進行羊水染色體核型和染色體微陣列分析[6]。

隨著醫(yī)學的發(fā)展，CMA在神經(jīng)發(fā)育障礙患者中得到廣泛的應(yīng)用。美國婦產(chǎn)科醫(yī)生指南(ACOG)指出，當超聲檢出胎兒的1個或多個主要結(jié)構(gòu)異常時，建議將CMA作為常規(guī)染色體核型分析的替代方法。Duan等[7]研究表明，CMA在核型正常的VM中可檢出6%的異常，是目前有效的產(chǎn)前診斷方法。而本研究中55例VM經(jīng)CMA檢測共檢出5例VOUS，檢出率為9.1%(5/55)。5例VOUS中，對1、2、3、5病例進行來源驗證，并找到了相應(yīng)的來源。病例4未進行來源驗證，經(jīng)隨訪嬰兒無明顯表型異常。病例6為Y染色體存在3.75 Mb重復，該重復為可能良性CNVs，經(jīng)CMA驗證，該重復來源于父親。病例7為15號染色體存在1.74 Mb重復，該重復為可能致病性CNVs，經(jīng)CMA驗證，該重復來源于母親。雖然這些病例進行了來源驗證，但就目前對人類基因組的認識和數(shù)據(jù)庫的積累，仍無法對全部結(jié)果給出確切的臨床性質(zhì)判讀，也給臨床醫(yī)師的診斷帶來新的挑戰(zhàn)，這也是該技術(shù)的局限性。所以，要做好檢測前后的咨詢工作，對VOUS、可能良性CNVs、可能致病性CNVs仍要進行跟蹤性隨訪[8]。相信隨著CMA的應(yīng)用和數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的不斷更新及改進，未來這些異常結(jié)果的發(fā)生率會逐漸降低。

本研究結(jié)果表明，55例VM中檢出4例pCNVs，檢出率為7.3%，與宓嫻賢等[9]報道的5.46%結(jié)果相近；與彭奕賢等[10]報道的26.6%存在一定差異，這種差異的原因不排除樣本不足引起的結(jié)果偏倚或與VM合并其他超聲畸形有關(guān)。由此可見，除染色體核型異常外，pCNVs也是VM胎兒較常見的染色體異常[8]。本研究4例pCNVs均可導致胎兒智力低下、發(fā)育遲緩，這也可能是引起VM的原因。4例pCNVs中，2例為21-三體，由此可見VM是該綜合征常見的軟指標[11]。本研究中，單獨使用核型分析檢測出3例異常核型，檢出率為5.5%；單獨使用CMA檢測出4例異常核型，檢出率為7.3%；聯(lián)合檢測的異常核型檢出率為7.3%，單獨與聯(lián)合檢測結(jié)果經(jīng)卡方檢驗比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。聯(lián)合檢測雖未增加異常核型的檢出率，但兩者聯(lián)合可進一步了解染色體核型異常。如核型分析可檢出平衡易位、倒位和小標記染色體等；CMA可檢出單親二體、非平衡易位和<5 Mb的 pCNVs等，因此，兩者聯(lián)合可彌補各自的不足。

綜上所述，輕度VM胎兒進行核型分析和CMA檢測，有助于發(fā)現(xiàn)胎兒染色體核型和染色體亞顯微結(jié)構(gòu)的異常。兩者相結(jié)合，使異常結(jié)果得到驗證，2種檢測方法又互為補充，從而為產(chǎn)前咨詢提供更詳細和更全面的胎兒預后的依據(jù)。本研究樣本量不足，實驗結(jié)果可能存在一定的偏倚，還需要進一步擴大樣本量來驗證。