左滿興 薛磊 崔洪亮

摘要 [目的]研究微生物發(fā)酵技術對造紙法再造煙葉品質的影響。[方法]使用一種增香復合微生物發(fā)酵處理再造煙葉原料，通過GC-MS分析了其主要香味成分，并比較了不同處理對再造煙葉纖維特性及產品各類香氣成分的影響。[結果]增香復合微生物發(fā)酵處理可使煙草原料纖維分絲帚化效果更好，顯著提升制漿及感官品質;致香成分中，6大類45種化合物的總量較對照樣最高增幅達到20.93%。微生物發(fā)酵處理樣中，香味物質如茄酮、巨豆三烯酮、糠醇、3-氧代-α-紫羅蘭醇、香茅醛、新植二烯和麥芽酚等含量明顯增加;微生物發(fā)酵處理造紙法再造煙葉樣品較對照樣在煙氣細膩度、香氣、甜潤感、灼熱和干燥感、余味舒適度等方面均有明顯改善。[結論]該研究可為利用生物技術改善造紙法再造煙葉品質的研究及應用提供參考。

關鍵詞 再造煙葉;微生物;煙草纖維;香味成分;感官質量

中圖分類號 TS44+4 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）19-0194-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.051

Abstract [Objective] To study the effect of microbial fermentation technology on the quality of papermaking process reconstituted tobacco （PMRT for short）.[Method]An aromaenhancing complex microorganism was used for the fermentation of PMRT.The main aroma components were analyzed by GCMS，and the effects of different treatments on the smoke quality of PMRT and tobacco fiber were compared.[Result]The experimental results showed that：Tobacco fiber has better silk separation effect and better pulp quality by aromaenhancing complex microorganism treatment.The total amount of 45 compounds in 6 categories of PMRT fermented by aromaenhancing complex microorganism was 20.93% higher than that of the control.Compared with the control，the contents of aroma components such as solanone，megastigmatrienone，furfuryl alcohol，3oxoαionol，citronellal，neophytadiene and maltol in the microbial fermentation samples were significantly increased.The PMRT treated by microbial fermentation were significantly improved in terms of flue gas fineness，aroma，sweetness，heat and dryness，and aftertaste comfort.[Conclusion]The study can provide reference for the research and application of biotechnology to improve the quality of PMRT.

Key words Reconstituted tobacco;Microorganism;Tobacco fiber;Aroma components;Sensory quality

基金項目 陜西中煙工業(yè)有限責任公司重點科技項目（ZB15006）。

作者簡介 左滿興（1974—），男，安徽貴池人，工程師，從事卷煙配方研究。

收稿日期 2020-03-30

造紙法再造煙葉（Papermaking process reconstituted tobacco，簡稱PMRT）是以廢棄的煙梗、煙葉碎片、煙末等為原料，利用造紙法工藝制成的煙草再生利用產品[1]。造紙法再造煙葉具有填充值高、可塑性強、燃燒性能好、焦油釋放量低等特性[2-3]。造紙法再造煙葉作為卷煙配方尤其是低焦油卷煙配方中的重要組分，可有效改善卷煙填充結構和燃燒性能，降低卷煙焦油和煙堿等有害物釋放量[4-6]，是卷煙降焦減害的有效技術措施之一。然而，由于造紙法再造煙葉原料多為煙梗、低次煙葉或煙末等煙草廢棄物資源，造紙法再造煙葉存在著香氣較少、刺激較明顯、口感不理想等缺陷，影響了其在卷煙產品中的應用效果和添加量。因此，如何提升造紙法再造煙葉品質、解決其感官質量缺陷是煙草領域的重要研究方向。

目前，許多學者通過改變造紙法再造煙葉的生產工藝來提升再造煙葉品質[7-9]，同時利用生物技術來改進造紙法再造煙葉品質缺陷的研究也逐漸成為熱點[10]。近年來，部分研究利用酶技術[11-13]或微生物發(fā)酵處理[14-16]，通過將再造煙葉原料如煙梗中的大分子物質進行轉化分解[17-18]，或對原料浸提液進行發(fā)酵處理后再涂布于再造煙葉基片，以期改善造紙法再造煙葉內在品質。此類研究多是通過生物技術手段從造紙法再造煙葉制造環(huán)節(jié)改善再造煙葉品質。然而，對于如何通過微生物發(fā)酵技術直接提高造紙法再造煙葉成品品質的研究較為缺乏。

筆者探討微生物發(fā)酵技術對造紙法再造煙葉成品內在質量的影響，并對再造煙葉成品中主要致香成分進行分析，結合感官評價驗證微生物發(fā)酵技術在提高造紙法再造煙葉品質的應用效果，以期為利用生物技術改善造紙法再造煙葉品質的研究及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料 試驗儀器：6890-5973 GC-MS氣質聯(lián)用儀（美國Agilent公司）;RM-200型轉盤式吸煙機（德國Borgwaldt KC公司）;HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm，美國Agilent公司）;劍橋濾片（英國Cerulean公司）;OLYMPUS-BX51光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。試驗試劑：LB 固體培養(yǎng)基（商品化試劑）、正十七烷、異丙醇、二氯甲烷等試劑均為國產分析純。

供試造紙法再造煙葉由云南瑞升煙草技術集團有限公司生產。

供試增香復合微生物：包含枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Y1、X7、X8（菌種專利保藏號分別為CGMCC No.13602、CGMCC No.13603和CGMCC No.13604），增香復合微生物專利配方為Y1∶X7∶X8=（0.001～1）∶（0.001～1）∶（0.001～1）。

1.2 方法

1.2.1 煙草提取液的制備。準確稱取 1.00 kg 煙末、煙梗及碎煙片（按1∶1∶1混合），加入7.00 kg熱水，于 70 ℃下提取45 min，過濾，獲得煙草提取液。

1.2.2 浸提液發(fā)酵。

1.2.2.1 休息細胞的制備。采用 LB 培養(yǎng)基將微生物培養(yǎng)到 OD600值為 1.0 左右停止（此時細胞濃度約為 135個細胞/mL），離心去掉培養(yǎng)基，收集細胞置于 pH 為 7.0的PBS 緩沖液中，作為休息細胞備用[19]。

1.2.2.2 造紙法再造煙葉微生物發(fā)酵。將增香復合微生物休息細胞按造紙法再造煙葉原料投料量0.1%（T1處理）和0.2%（T2處理）的添加量制成菌懸液，將菌懸液均勻噴灑在供試造紙法再造煙葉原料表面，以等量滅活休息細胞處理作對照（CK），置于特定溫濕度條件下發(fā)酵48 h，隨后將原料按照再造煙葉生產工藝（圖1）制成再造煙葉產品。待再造煙葉絲平衡至水分為（12.0±0.5）%，取少量煙草纖維，采用光學顯微鏡觀察其形態(tài)特征。

1.2.3 造紙法再造煙葉樣品的制備。將上述處理后的造紙法再造煙葉絲卷制成煙支，置于溫度為（22±1）℃、相對濕度為（60±2）%的恒溫恒濕箱中平衡水分48 h后，挑選重量、吸阻符合要求的煙支樣品用于感官質量評吸和香味成分分析。

1.2.4 香味成分分析樣品的制備。根據GB/T 19609―2004[20]的要求，對樣品主流煙氣中的粒相物進行捕集，將煙支在標準抽吸條件下通過吸煙機抽吸，用劍橋濾片捕集主流煙氣，將濾片收集放入三角瓶中，加入40 mL二氯甲烷和10 μL內標溶液（內標液為5 mg/mL異丙醇），靜置15 min后再振蕩40 min，過濾，將濾液濃縮至1 mL后進行GC-MS分析。

1.2.5 香味物質GC-MS分析條件。

1.2.5.1 色譜條件。進樣口溫度：250 ?℃;進樣量：1.0 μL;載氣：He;分流比：40∶1;柱流速：0.8 mL/min;程序升溫：初始溫度50 ?℃保持2 min，以5 ?℃/min升溫至160 ?℃，然后再以8 ℃/min升到260 ?℃，保持15 min。傳輸線溫度：280 ℃。

1.2.5.2 質譜條件。EI電子能量：70 eV;掃描范圍：35～550 amu;離子源溫度：230 ?℃;溶劑延遲：2 min;質譜庫：NIST譜庫和WILEY標準數據庫。

對每個峰進行串聯(lián)檢索，并將各鑒定物質峰面積與內標物峰面積的比值作為定量對比分析依據，定量結果以μg/支表示，分析煙氣中香味成分。

1.2.6 感官評吸。由陜西中煙工業(yè)有限責任公司技術中心具有卷煙感官評吸技術資格的7人組成感官評吸評委組，采用暗評的形式，參照煙草行業(yè)YC/T 498—2014再造煙葉（造紙法）感官評價方法[21]的要求，對樣品煙支進行感官質量打分和綜合評價。

1.3 數據處理 ?利用Microsoft Excel和DPS軟件進行數據處理及統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 微生物處理對再造煙葉纖維的影響 采用光學顯微鏡分析了微生物處理對再造煙葉打漿過程中煙草纖維表面形貌的影響，結果見圖 2。從圖2可以看出，空白樣 （圖2-CK） 的表面較為平整，受制漿磨損影響較小，輪廓邊界較規(guī)整，有明顯形狀外形;而經過微生物處理后打漿 （圖2-T1、T2） ，煙草纖維的表面粗糙破損情況嚴重，有分絲起毛現象，并產生少量細小的纖維碎片，輪廓邊界已經變得很不規(guī)則，無明顯形狀外形。這主要是由于微生物能夠分解煙草原料中的木質素、纖維素，促進制漿時吸水潤脹[22-23]，使煙草原料受盤磨的切斷和擠壓作用更顯著，從而產生大量的細小碎片，增加煙草纖維的比表面積，為再造煙葉產品定型后涂布過程的料液吸收帶來優(yōu)勢，從而增加再造煙葉產品香味成分含量。微生物處理不僅可提高制漿效果，同時，也可加快制漿過程，為再造煙葉生產企業(yè)節(jié)能減排提供一定幫助。

2.2 香味物質總量的變化 樣品主流煙氣中的香味物質由GC-MS分析，得到的各組分質譜圖經質譜庫檢索，對照和2組處理樣中鑒定出相同的香味化合物共計45種。與對照相比，經增香復合微生物發(fā)酵處理的造紙法再造煙葉2組樣品的香味物質總量均有提升，T1和T2處理樣的45種香味物質總量分別為363.11和417.91 μg/支，較對照樣分別提升5.08% 和20.93%。同時，45種化合物中，類胡蘿卜素類降解生成的香氣物如新植二烯、巨豆三烯酮和3-氧代-α-紫羅蘭醇，西柏烷類降解生成的香氣物如茄酮[24-25]，氨基酸降解生成的香氣物如吲哚和3-甲基-1H-吲哚[26]，美拉德反應生成的香氣物如糠醇、糠醛和5-（羥甲基）-2-呋喃甲醛等香味物質[27-28]的含量在增香復合微生物發(fā)酵處理樣中均比對照樣有不同程度的提高。

為便于分類比較，將45種化合物按其官能團不同可分為6大類：其中，酮類化合物13種，醇類化合物7種，醛類化合物4種，萜烯類化合物6種，酯類化合物4種，苯及稠環(huán)芳烴類化合物11種。微生物發(fā)酵處理的造紙法再造煙葉中的各類化合物含量較對照樣有不同程度的提高（圖3）。

2.3 酮類化合物含量的變化 如表1所示，增香復合微生物發(fā)酵處理的造紙法再造煙葉中，13種酮類化合物的含量較對照樣有不同程度的提高，其中T2處理樣較對照樣中酮類化合物總量提高了34.48%。多數酮類化合物是由煙葉中類胡蘿卜素降解所產生的，該類物質是形成烤煙細膩、高雅和清香的主要成分，酮類化合物香味閾值相對較低，是對煙葉香氣質量構成貢獻率較大的一類物質。與對照相比，巨豆三烯酮、茄酮、2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、3，5-二羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮的含量在微生物發(fā)酵的造紙法再造煙葉T2處理樣中分別提升了28.42%、35.56%、36.43和49.69%。同時研究表明，這4種酮類香味物質對于提高煙氣天然煙香、甜香、改變粗劣氣息有明顯效果。

2.4 醇類化合物含量的變化 如表2所示，樣品中共同檢測到的醇類化合物有7種。研究表明，醇類化合物具有清新的花香、果香，其中糠醇、3-氧代-α-紫羅蘭醇、植醇和豆甾醇具有增強煙草自然煙香和清甜感的作用，能給卷煙帶來清甜的香韻，使煙氣有細膩感。與對照相比，在經增香復合微生物發(fā)酵的造紙法再造煙葉T1處理樣中，上述4種醇類香味物質合計含量增加了13.67%，T2處理樣中增加了19.61%，尤其是糠醇和3-氧代-α-紫羅蘭醇，在T2處理樣中分別較對照增加了124.56%和38.42%。

2.5 醛類化合物含量的變化（表3） 醛類化合物在卷煙調香中起到豐富煙香和甜潤感的作用。其中，糠醛、香茅醛、5-（羥甲基）-2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛是分別具有調制烘烤香、堅果香、果香、酒香風味的香氣物質。與對照相比，經增香復合微生物發(fā)酵的造紙法再造煙葉T2處理樣中，這4種醛類香氣物質合計增幅為43.57%，其中香茅醛增幅最高，為47.36%。

2.6 萜烯類化合物含量的變化 如表4所示，樣品中共同檢測到的萜烯類化合物有6種。與對照相比，增香復合微生物發(fā)酵的造紙法再造煙葉T2處理樣中的此類化合物總量增加了12.48%。萜烯類化合物是煙草中重要成分，能改進和提高煙香的自然風味。而其中的新植二烯、D-檸檬烯、3-壬烯、膽甾烷-3，5-二烯是形成烤煙細膩、高雅和清香的主要成分，其香氣閾值較低。與對照相比，上述4種萜烯類香味物質合計在T1處理樣中增加了2.65%，在T2處理樣中增加了13.51%，尤其是D-檸檬烯和新植二烯，在T2處理樣中分別較對照增加了59.09%和11.62%。

2.7 酯類化合物含量的變化 煙草中酯類化合物對煙草的香氣和吃味有一定的影響，可以增加煙氣的醇和感。如表5所示，增香復合微生物發(fā)酵的造紙法再造煙葉T1處理樣中4種酯類化合物合計較對照樣變化不大，但T2處理樣較對照樣提高了9.85%。

2.8 苯及稠環(huán)芳烴類化合物含量的變化 如表6所示，樣品中共同檢測到的苯及稠環(huán)芳烴類化合物有11種。與對照相比，增香復合微生物發(fā)酵的造紙法再造煙葉T1和T2處理樣中的此類化合物含量分別增加了7.46%和18.49%。苯及稠環(huán)芳烴類物質能增加煙氣的豐滿度，如吲哚、3-甲基-1H-吲哚、麥芽酚、4-乙基-苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、2，3′-二吡啶可調配豆香、辛香、焦甜香，提高香氣濃郁度等。與對照相比，這6種苯及稠環(huán)芳烴類香味物質合計在T1處理樣中增加了23.01%，在T2處理樣中增加了42.48%，尤其是麥芽酚含量在T1和T2處理樣中分別較對照增加了127.75%和118.19%。

2.9 感官質量變化 通過評吸比較造紙法再造煙葉樣品感官品質差異，結果見表7。由表7可知，增香復合微生物發(fā)酵處理樣品的整體感官質量均好于未接種對照樣，對供試造紙法再造煙葉煙氣的香氣、雜氣和干燥感有所改善，對煙味指標改善不明顯。其中，處理樣T2的感官質量得分較對照樣由72.9分提高到77.6分，主要表現為煙氣細膩度較好，香氣有明顯提升，甜潤感增加，煙氣的雜氣、灼熱和干燥刺激感降低，余味殘留明顯減輕。說明經增香復合微生物發(fā)酵可提升供試造紙法再造煙葉的感官質量。

3 結論

（1）微生物處理煙草原料后，制漿過程中煙草纖維的表面粗糙破損情況嚴重，有分絲起毛現象，并產生少量細小的纖維碎片，纖維輪廓邊界已經變得很不規(guī)則，無明顯形狀外形，使煙草原料纖維分絲帚化效果更好，顯著提升制漿品質。

（2）施加微生物發(fā)酵處理的樣品中6大類45種化合物總量較對照樣最高增幅為20.93%。再造煙葉中占比較大的醛類、醇類、酮類和苯及稠環(huán)芳烴類化合物中，類胡蘿卜素降解物、西柏烷類降解物、氨基酸降解物和美拉德反應物等煙草重要香味物質，如茄酮、巨豆三烯酮、糠醇、3-氧代-α-紫羅蘭醇、香茅醛、新植二烯、麥芽酚等含量均有明顯增加。

（3）感官評吸結果表明，微生物發(fā)酵處理造紙法再造煙葉樣品較對照樣在煙氣細膩度、香氣、甜潤感、雜氣、灼熱和干燥感、余味舒適度等方面均有明顯改善。

總之，施加增香復合微生物發(fā)酵處理可提高造紙法再造煙葉中香味成分含量，提升造紙法再造煙葉整體感官品質。

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