聶志華 朱蕾蕾

（1. 天津科技大學(xué)，天津 300457；2. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

L-谷氨酸是人體的非必需氨基酸，由葡萄糖轉(zhuǎn)變而來［1］，是食物蛋白質(zhì)的重要組成，參與動(dòng)物、植物和微生物中的許多重要化學(xué)反應(yīng)，在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程中占重要地位［2］。L-谷氨酸作為一種重要氨基酸被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、藥品和化妝品等領(lǐng)域，是世界上產(chǎn)量最大的氨基酸。在氨基酸市場中，L-谷氨酸每年生產(chǎn)總量約250萬t，占氨基酸生產(chǎn)總量的60%-70%［3］。目前發(fā)酵法是生產(chǎn)谷氨酸的主要方法，而主要的生產(chǎn)菌株是谷氨酸棒桿菌。谷氨酸棒桿菌大多為生物素缺陷型，生物素濃度過低會(huì)影響谷氨酸棒桿菌的生長，生物素過量則影響谷氨酸的分泌［4-6］。在谷氨酸發(fā)酵時(shí)控制生物素亞適量是谷氨酸發(fā)酵的優(yōu)化操作模式之一［7］。

近幾年，谷氨酸棒桿菌的氨基酸外排系統(tǒng)越來越受到關(guān)注［8-10］。在谷氨酸棒桿菌中鑒定出的谷氨酸外排蛋白主要有兩個(gè)：MscCG（最初命名為 NCgl1221）和 MscCG2，均為機(jī)械敏感通道蛋白［11-12］。其中，MscCG是主要的谷氨酸外排蛋白，其外排作用受到細(xì)胞膜張力的控制，而細(xì)胞膜張力則受生物素濃度的影響。因此，只有在合適生物素濃度范圍內(nèi)才能使外排蛋白通道打開從而外排大量的谷氨酸。研究發(fā)現(xiàn) MscCG折疊成跨膜七聚體，其中每個(gè)亞基具有4個(gè)跨膜螺旋［13］。有文獻(xiàn)報(bào)道通過原生質(zhì)球的單通道記錄了MscCG在谷氨酸棒桿菌的天然膜中的機(jī)械敏感性通道活性，結(jié)果表明MscCG具有約340 pS的電導(dǎo)，同時(shí)確定了MscCG的半激活需要約5.5 mN/m的膜張力［14］。而且研究證明了MscCG門控受谷氨酸棒桿菌膜的“軟”特性影響顯著，可利用作為MscS類機(jī)械敏感通道的MscCG專門外排谷氨酸［15-17］。因此，在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)MscCG蛋白將會(huì)對(duì)谷氨酸的胞外積累起到促進(jìn)作用。

本研究在谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC13032中表達(dá)了MscCG蛋白，并通過M2P BioLector微型生物反應(yīng)器［18］在線實(shí)時(shí)檢測不同濃度的生物素對(duì)谷氨酸發(fā)酵中的生物量、pH和溶氧的影響，旨為谷氨酸發(fā)酵的優(yōu)化控制提供一定的理論依據(jù)和實(shí)用參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 菌種ATCC13032、ATCC13032△mscCG、質(zhì)粒pTRCmob-mscCG與pTRCmob均由中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所鄭平課題組贈(zèng)予。

1.1.2 培養(yǎng)基 LBG 固體培養(yǎng)基：5 g/L酵母膏，10 g/L蛋白胨，5 g/L氯化鈉，5 g/L葡萄糖，1.8 g/L瓊脂；25 μg/mL卡那霉素。

CGXII種子培養(yǎng)基：5 g/L葡萄糖，20 g/L硫酸銨，5 g/L尿素，1 g/L磷酸二氫鉀，1.3 g/L三水合磷酸二氫鉀，80 g/L MOPS，0.01 g/L氯化鈣，0.25 g/L七水合硫酸鎂，0.01 g/L七水合硫酸亞鐵，0.01 g/L一水合硫酸錳，0.001 g/L七水合硫酸鋅，0.2 mg/L硫酸銅，0.02 mg/L六水合氯化鎳，0.03 g/L 二羥基苯甲酸，0.1 mg/L Thiamine HCl VB1，2.5 μg/L-4 μg/L 生物素，25 μg/mL卡那霉素，用氫氧化鈉調(diào)pH為7.0。

CGXII發(fā)酵培養(yǎng)基：80 g/L葡萄糖，20 g/L硫酸銨，5 g/L尿素，1 g/L磷酸二氫鉀，1.3 g/L三水合磷酸二氫鉀，80 g/L MOPS，0.01 g/L 氯化鈣，0.25 g/L七水合硫酸鎂，0.01 g/L七水合硫酸亞鐵，0.01 g/L一水合硫酸錳，0.001 g/L七水合硫酸鋅，0.2 mg/L硫酸銅，0.02 mg/L六水合氯化鎳，0.03 g/L二羥基苯甲酸，0.1 mg/L Thiamine HCl VB1，0.25 μg/L-4 μg/L 生物素，25 μg/mL卡那霉素，用氫氧化鈉調(diào)pH為7.0。1.1.3 主要儀器及設(shè)備 見表1。

表1 主要儀器設(shè)備及生產(chǎn)廠家

1.2 方法

1.2.1 重組菌構(gòu)建 將質(zhì)粒pTRCmob-mscCG與空載體pTRCmob分別轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌ATCC13032△mscCG中，獲得重組菌ATCC13032△mscCG/pTR Cmob-mscCG與ATCC13032△mscCG/pTRCmob。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵檢測外排蛋白MscCG對(duì)L-谷氨酸發(fā)酵的影響 分別挑取ATCC13032，ATCC13032△mscCG，重組菌ATCC13032△mscCG/pTRCmob和ATCC13032△mscCG/pTRCmob-mscCG接種于LBG固體培養(yǎng)基中活化24 h；活化后接入裝有10ml CGXII種子培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，在30℃、220 r/min條件下培養(yǎng)12 h；最后以起始OD600為0.15的接種量從種子培養(yǎng)基接種至裝有25 mL CGXII發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在生物素濃度為0.5 μg/L、30℃、220 r/min的條件下培養(yǎng)40 h，發(fā)酵結(jié)束后將菌體離心并取上清液，使用SBA-40D生物傳感分析儀檢測發(fā)酵液中L-谷氨酸的含量。

1.2.3 生物素梯度對(duì)L-谷氨酸發(fā)酵的影響 以重組菌ATCC13032△mscCG/pTRCmob-mscCG為研究對(duì)象，在發(fā)酵裝置中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。將M2P BioLector微型生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)速設(shè)置為1 000 r/min，以生物素添加量為變量，選取0.25 μg/L、0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、3 μg/L和4 μg/L共6個(gè)梯度，用CGXII發(fā)酵培養(yǎng)基分別進(jìn)行3個(gè)批次實(shí)驗(yàn)，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并繪制曲線圖。發(fā)酵裝置BioLector微型孔發(fā)酵反應(yīng)板總體積為3 mL，其中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為1.2 mL。

1.2.4 L-谷氨酸發(fā)酵過程參數(shù)的檢測方法 菌體生物量、發(fā)酵液中的pH和溶氧均在微孔板中由M2P BioLector微型生物反應(yīng)器在線監(jiān)測；經(jīng)過16 h、24 h、30 h和40 h發(fā)酵后，分別取樣、離心并取上清液，利用SBA-40D生物傳感分析儀分別測定發(fā)酵液內(nèi)L-谷氨酸、乳酸的含量。

2 結(jié)果

2.1 重組菌的構(gòu)建及驗(yàn)證

將質(zhì)粒pTRCmob-mscCG轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌ATCC13032△mscCG后，進(jìn)行質(zhì)粒提取。圖1為質(zhì)粒pTRCmob-mscCG的電泳圖，在8 029 bp附近出現(xiàn)目標(biāo)條帶。將提取的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測得的序列與原mscCG序列完全一致。說明質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入。

2.2 表達(dá)外排蛋白MscCG對(duì)L-谷氨酸產(chǎn)量的影響

本實(shí)驗(yàn)在谷氨酸棒桿菌ATCC13032△mscCG中用質(zhì)粒表達(dá)外排蛋白MscCG，同時(shí)與菌株ATCC 13032、ATCC13032△mscCG、ATCC13032△mscCG/pTRCmob搖瓶發(fā)酵后的L-谷氨酸產(chǎn)量進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，敲掉ATCC13032基因組上mscCG基因的菌株（ATCC13032△mscCG）和敲掉ATCC13032基因組上mscCG基因且表達(dá)空載體pTRCmob的菌株（ATCC13032△mscCG/pTRCmob）搖瓶發(fā)酵幾乎沒有L-谷氨酸的排出；表達(dá)基因組上外排蛋白MscCG的菌株（ATCC13032）搖瓶發(fā)酵L-谷氨酸的產(chǎn)量為8.6 g/L；而用質(zhì)粒表達(dá)外排蛋白MscCG的菌株（ATCC13032△mscCG/pTRCmob-mscCG）搖瓶發(fā)酵L-谷氨酸的產(chǎn)量為11.4 g/L（圖2）；綜上，說明用表達(dá)載體（pTRCmob-mscCG）在ATCC13032△mscCG中表達(dá)外排蛋白MscCG能夠提高搖瓶發(fā)酵中L-谷氨酸的產(chǎn)量，提高了32%。

圖1 質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入驗(yàn)證電泳圖

圖2 表達(dá)外排蛋白MscCG對(duì)L-谷氨酸產(chǎn)量的影響

2.3 不同生物素添加量對(duì)菌體生長及L-谷氨酸產(chǎn)量的影響

隨生物素添加量濃度（0.25 μg/L-4 μg/L）的增加，谷氨酸棒桿菌的生物量從6.89提高到23.42（圖3-A）。其中，0.5 μg/L生物素是本實(shí)驗(yàn)條件下的亞適量，L-谷氨酸的產(chǎn)量最高，為15.6 g/L（圖3-D），菌體生物量為8.18（圖3-A）；在4 μg/L生物素下谷氨酸的產(chǎn)量最低，為4 g/L，但菌體生物量最高，為23.42?？梢姡锼靥砑恿繉?duì)谷氨酸棒桿菌的生長及L-谷氨酸產(chǎn)量的影響顯著，在發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素濃度越高，菌體生長越快，最終菌體生物量越高；而生物素含量適中才能使谷氨酸的積累量達(dá)到最高。

2.4 不同生物素添加量下發(fā)酵液中溶氧的變化

谷氨酸發(fā)酵中的溶氧濃度是影響發(fā)酵的關(guān)鍵因素，對(duì)谷氨酸棒桿菌的生長和谷氨酸的生產(chǎn)有重要的影響。在40 h發(fā)酵培養(yǎng)過程中，不同生物素的發(fā)酵液中溶氧的變化也不同（圖3-A）；低生物素的發(fā)酵液中溶氧較高，其原因可能是菌體的生物量較低（圖3-A），發(fā)酵液中消耗的氧較少。高生物素的發(fā)酵液中溶氧較低，其原因可能是菌體的生物量較高（圖3-A），發(fā)酵液中消耗的氧較多，并且高生物素的發(fā)酵液中溶氧最早開始下降（圖3-B）。

2.5 不同生物素添加量對(duì)培養(yǎng)基中pH的影響

谷氨酸發(fā)酵過程需要對(duì)pH進(jìn)行控制，pH過高或過低都會(huì)影響菌的生長與谷氨酸的生成。在40 h發(fā)酵培養(yǎng)過程中，不同生物素的發(fā)酵液中pH的變化也不同，并且高生物素的發(fā)酵液中pH最早開始下降（圖3-C）；低生物素的發(fā)酵液中pH下降較慢，其原因可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的谷氨酸和乳酸較少；高生物素的發(fā)酵液中pH下降較快，其原因可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸較多（圖3-E）。

2.6 不同生物素添加量對(duì)副產(chǎn)物乳酸的影響

乳酸作為谷氨酸發(fā)酵過程的主要副產(chǎn)物，其量越小對(duì)谷氨酸發(fā)酵越有利。隨生物素添加量濃度（0.25 μg/L-4 μg/L）的增加，乳酸從0.1 g/L提高到9.8 g/L。其中，當(dāng)生物素濃度為0.25 μg/L與0.5 μg/L時(shí)，發(fā)酵過程中幾乎不產(chǎn)乳酸（低于1 g/L）；當(dāng)生物素濃度為1 μg/L-4 μg/L時(shí)，發(fā)酵過程中乳酸開始積累，且隨生物素濃度的增加積累量也在增加（圖3-E）。

圖3 L-谷氨酸發(fā)酵過程中的參數(shù)

3 討論

在使用谷氨酸棒桿菌作為生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸時(shí)，生物素的用量直接影響生產(chǎn)菌的生長、增殖和代謝，并通過影響細(xì)胞膜中脂質(zhì)的合成來影響細(xì)胞膜的通透性［19］。當(dāng)生物素控制在亞適量時(shí)，不僅能提供給菌體生長所必須的生長因子，還能使菌體代謝失調(diào)。由于細(xì)胞膜是磷脂雙分子層組成的，當(dāng)磷脂含量減少到正常量的一半時(shí)，細(xì)胞發(fā)生變形［20］，機(jī)械敏感通道蛋白在細(xì)胞膜拉伸下打開通道使谷氨酸從胞內(nèi)排出，積累于發(fā)酵液中使得谷氨酸產(chǎn)量提高，而且谷氨酸棒桿菌代謝的副產(chǎn)物乳酸產(chǎn)量較低。當(dāng)生物素過量，由于細(xì)胞內(nèi)有大量的磷脂質(zhì)，使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜增厚，細(xì)胞仍能維持正常形態(tài)，機(jī)械敏感通道蛋白感受不到機(jī)械力，谷氨酸不易從胞內(nèi)排出，造成谷氨酸產(chǎn)量減少［21］；而且生物素過量（本文2 μg/L-4 μg/L生物素）時(shí)，菌體生長增殖速度加快，細(xì)胞液中的溶氧相對(duì)較低且最早下降，丙酮酸節(jié)點(diǎn)流量過多地流向乳酸途徑，從而減弱了L-谷氨酸途徑，谷氨酸產(chǎn)量減少，谷氨酸棒桿菌代謝的副產(chǎn)物乳酸產(chǎn)量升高；而大量的乳酸也使得發(fā)酵液中pH迅速下降［20-21］。當(dāng)生物素添加量過少（本文0.25 μg/L生物素）時(shí)，菌體生長所必需的生長因子量不足，導(dǎo)致菌體生長速度緩慢，細(xì)胞液中的溶氧相對(duì)較高，谷氨酸棒桿菌代謝的副產(chǎn)物乳酸產(chǎn)量較低，發(fā)酵液中pH下降較緩慢，但是谷氨酸的產(chǎn)量受菌體數(shù)量影響也相對(duì)較少。因此，在谷氨酸發(fā)酵過程中確定一個(gè)合適的生物素添加量是提高L-谷氨酸產(chǎn)量的有效手段。

本實(shí)驗(yàn)通過在谷氨酸棒桿菌ATCC13032△msc-CG中表達(dá)MscCG外排蛋白，研究其在發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸過程中，不同生物素添加量下菌體的生物量、溶氧、pH、L-谷氨酸產(chǎn)量及副產(chǎn)物乳酸的情況。結(jié)合圖3中的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸的過程中，生物素、生物量、谷氨酸產(chǎn)量、乳酸含量及pH與溶氧息息相關(guān)（圖4）。生物素添加量過少（本文0.25 μg/L生物素）時(shí)，雖然溶氧、pH條件合適，乳酸含量較低，但由于菌體生物量較低，谷氨酸仍不能夠大量積累。生物素添加量較多（本文2 μg/L-4 μg/L生物素）時(shí)，菌體生物量較高，導(dǎo)致發(fā)酵液中溶氧下降較快，谷氨酸發(fā)酵的副產(chǎn)物乳酸含量積累較多，且導(dǎo)致發(fā)酵液中pH下降迅速；較低的pH使得菌體活力下降，最終谷氨酸產(chǎn)量較少。因此，在實(shí)際谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸過程中，當(dāng)生物素濃度較高時(shí)應(yīng)該增大溶氧同時(shí)調(diào)節(jié)發(fā)酵液中的pH才能使L-谷氨酸產(chǎn)量達(dá)到最大，并且副產(chǎn)物乳酸的積累較少。生物素濃度滿足一定菌體生物量的需求且溶氧能夠滿足菌體生長代謝需求時(shí)，谷氨酸發(fā)酵副產(chǎn)物乳酸含量較少、pH處于合適值［22］，將有利于谷氨酸的積累。

圖4 生物素、生物量、溶氧、pH、谷氨酸、乳酸之間的關(guān)系

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)用表達(dá)載體（pTRCmob-mscCG）在ATCC13032△mscCG中表達(dá)MscCG外排蛋白能夠提高搖瓶發(fā)酵中L-谷氨酸的產(chǎn)量。通過用BioLector體系研究生物素對(duì)ATCC13032△mscCG/pTRCmobmscCG發(fā)酵產(chǎn)谷氨酸的影響，過程中監(jiān)測了生物量、發(fā)酵液中的溶氧、pH、谷氨酸、乳酸等發(fā)酵參數(shù)并討論了它們之間的聯(lián)系，明確了只有綜合考慮對(duì)生物素濃度、溶氧及pH值的動(dòng)態(tài)控制，才可能達(dá)到谷氨酸棒桿菌的最佳谷氨酸產(chǎn)量。