錢文江 汪步青 李葳茜 楊雪苗 劉洪偉 張麗萍

（1. 河北工業(yè)大學化工學院，天津 300130；2. 河北省科學院生物研究所，石家莊 050081）

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是一類革蘭氏陽性菌，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中能分解糖類生成乳酸，也被稱作乳酸發(fā)酵菌［1］。凝結(jié)芽孢桿菌在自然界中廣泛分布，其在生長繁殖過程中產(chǎn)生一種抗菌肽-凝結(jié)素，對多種致病菌都具有殺菌活性［2］。凝結(jié)芽孢桿菌不僅具有乳酸菌和雙歧桿菌相同的營養(yǎng)特征，還具有很強的耐酸、耐熱、耐鹽等性狀［3］。1998年，Hyronimus等［4］研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌I4能產(chǎn)生凝結(jié)素，它是一類抗菌肽類物質(zhì)，能夠抑制沙門菌、小球菌等諸多致病菌的生長。2006年，Huszcza等［5］發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌生長過程中會有多種表面活性素產(chǎn)生，其中surfactin是一種強大的脂肽類表面活性劑。同時，2009年，Kodali等［6］在凝結(jié)芽孢桿菌RK-02中分離出一種胞外多糖（EPS）具有乳化活性。2015年，趙鈺等［7］發(fā)現(xiàn)在凝結(jié)芽胞桿菌LL1103發(fā)酵液中存在可以抑制革蘭氏陽性菌生長的細菌素。劉全永等［8］發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽胞桿菌LU-B02發(fā)酵液對白色念珠菌生長有抑制作用。此外，也有研究表明凝結(jié)芽孢桿菌在生長過程中也會產(chǎn)生了乳糖酶、β-半乳糖苷酶、木聚糖酶、纖溶活性酶等物質(zhì)。

到目前為止，在NCBI上可以查詢到的凝結(jié)芽孢桿菌共有33株并且都完成了基因組測序。屬于同一菌種的細菌菌株的基因含量之間差異很大，而泛基因組的遺傳信息要比單個菌株的遺傳信息含量大得多［9］。泛基因組的概念是由Tettelin等［10］在2005年提出，泛基因組是指某一個物種所有存在的基因，它包括核心基因組（在全部菌株中都包含的基因），非必須基因組（只有部分菌株都含有的基因）和菌株具有的特有基因［11］。最近幾年，泛基因組分析在細菌和真菌功能基因挖掘中應(yīng)用廣泛［12］。根據(jù)泛基因總數(shù)與基因組個數(shù)的關(guān)系，細菌的泛基因組可以分為兩種類型，分別是開放型和閉合型［13］。開放型泛基因組是指隨著預(yù)測的基因組個數(shù)的增多，泛基因總數(shù)也相應(yīng)增加，而閉合型泛基因組是指在預(yù)測的基因組個數(shù)增加到某一數(shù)值時泛基因總數(shù)趨于不變［14］。對細菌的次級代謝產(chǎn)物進行分析時，傳統(tǒng)的分析方法可能會有局限性，但是分析細菌中已知的基因組數(shù)據(jù)，可能會挖掘出嶄新的次級代謝基因簇，并會有潛在的活性物質(zhì)出現(xiàn)［15］。

本研究從NCBI上找到了33株凝結(jié)芽孢桿菌的基因組，首先對其中11株有完整基因組水平的凝結(jié)芽孢桿菌進行了泛基因組分析，找出了其泛基因組的大小；隨后利用antiSMASH軟件對33株凝結(jié)芽孢桿菌的次級代謝基因簇進行挖掘，發(fā)現(xiàn)了其最可能產(chǎn)生的活性物質(zhì)［16］。本研究旨在對凝結(jié)芽孢桿菌的基因組信息進行探索，為以后研究凝結(jié)芽孢桿菌的進化，適應(yīng)和種群結(jié)構(gòu)的方式奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ genome）中查找到33株凝結(jié)芽胞桿菌的NCBI登錄號，在以GenBank格式下載獲得基因組信息。本研究中使用的33株凝結(jié)芽孢桿菌的基因組數(shù)據(jù)全部來自2020年1月5日之前在GenBank數(shù)據(jù)庫中提交的基因組信息，詳細信息如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 ANI值和DDH值分析 平均核苷酸一致性（ANI）可以用來判斷菌株是否為同一個種或亞種，而ANI值達到95%以上的菌株認為同一個種。本研究中使用在線軟件（http：//enve-omics.ce.gatech.edu/g-matrix/）中的ANI/AAI matrix對33株凝結(jié)芽孢桿菌的基因組ANI值進行計算［17］。

DDH值是指基因組與基因組之間的距離，通常將DDH值大于70%的菌株認為是同種菌株使用。使用在線軟件（http：//ggdc.dsmz.de/）中的GGDC計算33株凝結(jié)芽孢桿菌基因組的DDH值［18］。

1.2.2 基因組系統(tǒng)發(fā)育分析 對表1中33株凝結(jié)芽孢桿菌以genbank格式在NCBI數(shù)據(jù)庫上下載基因組數(shù)據(jù)，利用REALPHY（基于參考序列比對的系統(tǒng)發(fā)生構(gòu)建器）在線軟件進行全基因組數(shù)據(jù)比對，登錄http：//realphy.unibas.ch網(wǎng) 址，以GenBank格式進行上傳基因組數(shù)據(jù)，使用默認參數(shù)運行［19］。獲得的數(shù)據(jù)結(jié)果使用FigTree軟件構(gòu)建進化樹［20］。

1.2.3 核心基因組和泛基因組分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載如表1中11株組裝到完整基因組水平的凝結(jié)芽孢桿菌的基因組序列文件（.fna）和基因組注釋文件（.ppt）作為上傳數(shù)據(jù)，PGAweb軟件的PGAP-X模塊選擇GeneFamily Method（GF）算法對11個基因組進行分析，使用默認值運行［21］。下載結(jié)果文件中，選擇Orthologs_Cluster.txt文件，使用PanGP軟件進行泛基因組數(shù)據(jù)擬合［22］。

1.2.4 次級代謝產(chǎn)物合成基因簇分析 利用antiSMASH5.0（https：//antismash.secondarymetabolites.org）在線軟件的細菌分析模塊中［22］，輸入菌株NCBI登錄號，選擇relaxed預(yù)測模式對33株凝結(jié)芽孢桿菌次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇進行預(yù)測注釋，參數(shù)選用默認值［23］。

表1 研究分析中所使用的菌株

2 結(jié)果

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌基因組基本數(shù)據(jù)分析

如 表1所 示，到2020年1月12日 為 止，在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找到共有33株凝結(jié)芽孢桿菌的基因組，其中共有11株凝結(jié)芽孢桿菌基因組裝到完整基因組水平。由基因組數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，33株環(huán)狀芽孢桿菌的基因組大小范圍是2.059 47-3.694 84 Mb，而相應(yīng)的GC含量范圍為46.2%-47.5%，預(yù)測到的基因數(shù)范圍是2 064-3 660個。

2.2 ANI值和DDH值分析和基因組系統(tǒng)發(fā)育分析

通過使用ANI值和DDH值對33株凝結(jié)芽孢桿菌的序列同源性進行了評估。本研究以Bacillus coagulan P38的全基因組序列為參考，計算了菌株兩兩間DDH值（圖1-A）和ANI值（圖1-B）。結(jié)果顯示，其中20株凝結(jié)芽孢桿菌兩兩間ANI 值均>95%，DDH值均>70%是同一種凝結(jié)芽孢桿菌，而剩余的13株菌兩兩間的DDH值≤70%和ANI值≤95%，這13株菌不是同一種凝結(jié)芽孢桿菌［24］。通過使用REALPHY在線軟件將33株凝結(jié)芽孢桿菌基因組進行了比對，然后使FigTree軟件構(gòu)建進化樹。全基因組系統(tǒng)發(fā)育顯示（圖1-C），33株凝結(jié)芽孢桿菌在基因組系統(tǒng)進化樹上被歸為兩個分支，一個支包 括 有2-6、B4098、H-1、MA-13、XZL4、B4099、ATCC7050、DSM_1、DSM_1_1、ATCC7050_1、AF24-21、MGYG-HGUT-00191、AF24-19，其余菌株是另一支。最后，全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果與ANI值和DDH值的觀察結(jié)果一致。

2.3 核心基因組和泛基因組分析?

對11株組裝完整基因組水平的凝結(jié)芽孢桿菌進行了泛基因組分析。由圖2可知，共有34 647個蛋白質(zhì)編碼的基因用于聚類分析，被分為5 899個基因家族中，每個基因家族可能代表一個的同源基因。核心基因組是指在全部基因組中均包含的基因，如圖3所示，在11株凝結(jié)芽孢桿菌的基因組中，核心基因組是由2 152個基因家族組成，共有的核心基因組約占凝結(jié)芽孢桿菌泛基因組的36.48%。發(fā)現(xiàn)特有基因2 255個，占凝結(jié)芽孢桿菌泛基因組的38.22%。

基于全基因組基因聚類結(jié)果，我們使用PanGP軟件計算了泛基因組、核心基因組和基因組數(shù)目之間的關(guān)系。如圖3所示，泛基因組大?。═）與基因組數(shù)（X）關(guān)系的擬合方程為T=1 801.66X0.38+1 417.71（R2=0.999 98），擬合方程表明凝結(jié)芽孢桿菌的泛基因組中的基因數(shù)是隨著基因組個數(shù)的增加而增多。核心基因的個數(shù)（D）與基因組數(shù)（N）關(guān)系的擬合方程為D=1 751.08e-0.53N+2 151.5（R2=0.980 9）。根據(jù)公式推測出凝結(jié)芽孢桿菌的核心基因組有2 152個基因組成。不同的基因組中有相同的基因家族，當每個基因家族覆蓋的基因組個數(shù)增多時，這個基因家族中的基因就相對開放［25］。在曲線中顯示了泛基因數(shù)和核心基因數(shù)隨基因組增加而發(fā)生的變化。在該曲線中可以看出凝結(jié)芽孢桿菌的泛基因組是開放性的。

推測出每增加一個新的凝結(jié)芽孢桿菌基因組，大約有150個新基因被發(fā)現(xiàn)。如圖4所示，PanGP軟件計算了新基因家族數(shù)量（M）與基因組數(shù)（F）的關(guān)系，并計算出擬合方程為M=876.572F-0.71（R2=0.996 822）。

2.4 次級代謝產(chǎn)物合成基因簇

AntiSMASH是一種強大而全面的生物信息學工具，可用于識別和注釋編碼次生代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇，并已在該領(lǐng)域中廣泛使用［26］。利用antiSMASH軟件對33株凝結(jié)芽孢桿菌基因組中的次級代謝基因簇進行在線預(yù)測，預(yù)測結(jié)果總共注釋到8類、79個與次級代謝相關(guān)的基因或基因簇。與基因組大小無關(guān)，所測試的33株凝結(jié)芽孢桿菌中存在24株凝結(jié)芽孢桿菌都攜帶大量基因簇，并且這些基因簇編碼不同的潛在生物活性物質(zhì)。鑒定出有細菌素的基因簇平均在每個菌株中介于一到兩個之間。如圖5和表2所示，可以注釋到的次級代謝基因簇中有11個糖類（Saccharide）、30個細菌素（Bacteriocin）、2個脂肪酸（Fatty acid）、10個Ⅲ型聚酮化合物合酶（T3PKS）、18個內(nèi)酯（Betalactone）、3個LAP、2個萜烯（terpene）和3個硫肽（Thiopeptide）基因簇。Riazi等［27］在2009年研究發(fā)現(xiàn)了凝結(jié)芽孢桿菌ATCC 7050可以產(chǎn)生一種抗菌蛋白-乳酸菌素（Lactosporin），乳酸菌素和表2中對凝結(jié)芽孢桿菌ATCC 7050預(yù)測的次級代謝產(chǎn)物T3PKS都屬于核糖體途徑生成的抗菌蛋白類物質(zhì)。在線預(yù)測結(jié)果表明，目前預(yù)測凝結(jié)芽孢桿菌的主要次級代謝產(chǎn)物可能是細菌素、T3PKS、硫肽、內(nèi)酯和糖類等化合物。

圖1 33株凝結(jié)芽孢桿菌ANI值和DDH值分析及全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹分析

圖2 凝結(jié)芽孢桿菌基因組中核心基因和非必須基因

圖3 凝結(jié)芽孢桿菌的泛基因組分析

圖4 凝結(jié)芽孢桿菌新基因數(shù)量與基因組的關(guān)系

對于上述預(yù)測的基因簇中，如圖6和表3所示，共有43個基因簇和與已知基因簇具有一定的同源性。在預(yù)測到的43個基因簇中，有11個預(yù)測基因簇與Amylocyclicin基因簇同源相似度達到66%，另外還有1個預(yù)測基因簇與Amylocyclicin基因簇的同源相似度為50%，此外，還有18個預(yù)測基因簇與Fengycin基因簇的同源相似度為40%，有3個預(yù)測基因簇與Listeriolysin S 基因簇的同源相似度為37%，剩余10個預(yù)測基因簇與已知基因簇的同源相似度均低于30%，其中基因Cluster26和Cluster76與Kanamycin基因簇的同源相似度最低為1%。預(yù)測結(jié)果表明，凝結(jié)芽孢桿菌中預(yù)測基因簇與已知基因簇可能會有不同的產(chǎn)物。

3 討論

在NCBI數(shù)據(jù)庫中，有33株凝結(jié)芽孢桿菌菌株具有基因組相關(guān)數(shù)據(jù)，其中有11株組裝到完整基因組水平。對這其中的11株凝結(jié)芽孢桿菌基因組進行了的泛基因組分析，泛基因組中包含5 899個基因，具體是包括2 152個核心基因、2 255個特有基因和1 492個非必須基因，并且核心基因的個數(shù)占凝結(jié)芽孢桿菌泛基因總數(shù)的36.48%。通過計算泛基因組、核心基因組和基因組個數(shù)之間的公式，發(fā)現(xiàn)隨著基因組個數(shù)的增加，凝結(jié)芽孢桿菌的泛基因總數(shù)為上升的趨勢，說明凝結(jié)芽孢桿菌的遺傳物質(zhì)具有開放性，同時也說明凝結(jié)芽孢桿菌具有相對較高的遺傳多樣性。

通過對33株凝結(jié)芽孢桿菌的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇分析，共注釋到8類、79個次級代謝基因簇，平均每株凝結(jié)芽孢桿菌有2-3個次級代謝基因簇，其中重復(fù)出現(xiàn)最多的代謝通路是細菌素、T3PKS、硫肽、糖類和內(nèi)酯類化合物合成。此外，共有43個基因簇與已知基因簇具有一定同源性，其中有11個預(yù)測基因簇與Amylocyclicin基因簇同源相似度最高。這些結(jié)果表明，凝結(jié)芽孢桿菌可能具有相似的代謝產(chǎn)物合成途徑，最有可能的活性物質(zhì)包 括 有Fengycin、Amylocyclicin、Rhizocticin A和exopolysaccharide。孫天擁［28］對635株細菌的基因組進行了挖掘，共注釋出有40種、6 174個次級代謝基因簇，平均每株細菌有9-10個次級代謝基因簇。Jeske等［29］對13株浮霉狀菌的基因組進行了挖掘，共挖掘到102個次級代謝基因簇，平均每個基因組有7-8個次級代謝基因簇。凝結(jié)芽孢桿菌與這些細菌相比，發(fā)現(xiàn)的次級代謝基因簇數(shù)量較少，有新型物質(zhì)合成的可能性較低。

圖5 33株凝結(jié)芽孢桿菌中預(yù)測的次級代謝產(chǎn)物類型熱圖

表2 凝結(jié)芽孢桿菌中預(yù)測存在的次級代謝基因簇

表2 續(xù)表

表3 凝結(jié)芽孢桿菌中預(yù)測基因簇與已知基因簇的相似度

圖6 33株凝結(jié)芽孢桿菌中已知基因簇類型熱圖

4 結(jié)論

本研究對33株凝結(jié)芽孢桿菌中的11株具有完整基因組的凝結(jié)芽孢桿菌進行泛基因組分析，檢索到其泛基因組含有5 899個基因，其中特有基因有2 255個，核心基因組有2 152個基因；此外，通過對33株凝結(jié)芽孢桿菌使用antiSMASH軟件進行了次級代謝基因簇挖掘，共注釋到8類、79個次級代謝基因簇，其中主要的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇是關(guān)于內(nèi)酯、細菌素和糖類化合物。