張瑞平 楊峰 陳樂章 鄧星光 張大偉

（1. 四川大學生命科學學院，成都 610064；2. 四川省煙草公司攀枝花市公司，攀枝花 617099；3. 四川惠泰農業(yè)科技有限公司，成都 610200）

植物在生長和發(fā)育的過程中面臨著多種環(huán)境脅迫。植物為了在環(huán)境中生存，進化出一系列復雜的網絡調控機制來感受環(huán)境變化的信號并調整自身適應環(huán)境刺激。其中，植物激素對調節(jié)植物對逆境的響應起到至關重要的作用。此外，有研究證明線粒體交替呼吸途徑也參與植物對逆境的響應［1-2］。

油菜素內酯（Brassinosteroids，BRs）是一類重要的甾醇類植物激素，它廣泛參與調控植物的生長、細胞伸長、光形態(tài)建成、根與氣孔發(fā)育等多個過程［3-4］。目前BR在植物中的信號轉導途徑已經研究得比較清楚。BR首先被定位于細胞膜上的受體激酶BRI1所感知［5］。另一個膜受體激酶BAK1，能夠與BRI1結合，并起到增強BR信號的作用［6］。BR被感知后通過一系列級聯(lián)磷酸化反應最終激活BES1/BZR1家族轉錄因子的活性，從而調節(jié)成千上萬靶基因的表達［7］。BR除了調控植物生長發(fā)育過程之外，也參與調控植物對環(huán)境脅迫的響應如抗冷、抗鹽、抗干旱、抗重金屬毒害等［4，8-9］。

線粒體呼吸是植物產生ATP的主要來源。植物線粒體中除細胞色素呼吸途徑外，還具有一條對氰化物不敏感的電子傳遞途徑，即抗氰呼吸途徑，也叫交替呼吸途徑［2］。交替氧化酶（Alternative oxidase，AOX）是交替呼吸電子傳遞鏈中的末端氧化酶，對植物抗氰呼吸起到了主要的調控作用［10］，是植物調控抗逆網絡的重要成員。目前研究發(fā)現(xiàn)AOX參與調控植物對干旱脅迫［11］、鹽脅迫［12］、冷脅迫［13］以及病原物的抗性［14］。盡管如此，有關交替呼吸途徑調控植物抗逆的作用機制仍不清楚。

高溫是限制植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因子。隨著全球氣候的變暖，高溫導致的熱脅迫嚴重制約作物的生長、發(fā)育和產量，極端的高溫甚至造成植被的死亡［15］。因此，研究植物響應高溫脅迫的分子機制具有重要的意義。有研究發(fā)現(xiàn)BR可以在高溫下促進植物下胚軸的伸長［16］，然而其如何調控植物對高溫脅迫的響應還不清楚。本研究以本氏煙草為材料，探究交替呼吸途徑在BR調控植物響應高溫逆境中的作用機制，旨為培育高產抗逆遺傳改良作物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用植物材料為野生型本氏煙草（Nicotiana benthamiana）。

1.2 方法

1.2.1 化學試劑處理 BL（最具活性的BR）購自Wako Pure Chemical Industries公司（日本）。交替途徑抑制劑水楊基異羥肟酸（Salicylhydroxamic acid，SHAM）購自Sigma公司（美國）。所有的藥劑溶于含0.02%吐溫20的超純水中。各試劑濃度如下：BL，0.1 μmol/L；SHAM，1 mmol/L。對照為含0.02%吐溫20的超純水。

1.2.2 高溫脅迫處理 實驗所用植株在溫室內生長，溫度為25℃。光照強度為100 μmol/m-2·s。光照條件為每天16 h光照，8 h黑暗。將正常條件下生長3周的幼苗轉移至37℃熱脅迫環(huán)境下處理3 d。

1.2.3 病毒誘導的基因沉默 本實驗所用基因沉默方法為煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）介導的植物沉默方法（VIGS）。NbAOX1編碼區(qū)片段 用 引 物F：GGAGGATGGATCAAAGCAC & R：ATGGCAATAGCAGGAGCAG擴 增 所 得，片 段 純化后定向插入至pCRTM8/GW/TOPOTMTA Cloning Kit（Invitrogen，美國）質粒，通過GatewayTMLR ClonaseTMII Enzyme Mix試劑盒（Invitrogen）經LR反應后交換至pTRV2質粒。將構建好的質粒轉化至農桿菌GV3101株系。搖菌過夜后離心，用瞬時表達緩沖液（10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MES，和200 μmol/L乙酰丁香酮）重懸后靜置3 h。將含pTRV1的農桿菌重懸液和帶有目的片段的pTRV2農桿菌重懸液按照1∶1的比例混合，通過無菌針管注射至本氏煙葉片。

1.2.4 呼吸檢測方法 植物呼吸測定用Clark型氧電極（英國），取50 mg葉片并將其剪成碎片，懸浮于20 mmol/L的磷酸鉀緩沖液中（pH 6.8），等待15 min后進行呼吸測定，以避免機械損傷誘導呼吸。不加呼吸抑制劑時測得的數(shù)值為總呼吸Vt；同時加入細胞色素途徑抑制劑KCN（終濃度為1 mmol/L）和交替途徑抑制劑n-丙基沒食子酸（終濃度為0.5 mmol/L）測得剩余呼吸Vr；僅加入1 mmol/L KCN時測得的呼吸活性為V0。細胞色素呼吸值Vcyt=Vt-V0；交替呼吸值Valt=V0-Vr。上述呼吸量均以μmol O2·mg-1FW min-1表示。每個樣品重復測定6次，取平均值。

1.2.5 RNA提取及RT-PCR 葉片總RNA提取用了全式金公司（中國）植物總RNA提取試劑盒，提取方法參照說明書。反轉錄采用Invitrogen公司（美國）SuperScript III Reverse Transcriptase試劑盒。熒光定量PCR擴增實驗使用TaKaRa公司（日本）的SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行，NbAOX1（序列號：KF367455）基因表達檢測引物序列為F：TGAATGATAAGCAGCACGAT & R：TGACGGTCCAATAAGCAAA，內參基因NbACTIN（序列號：AY179605）擴增引物序列為F：ACTGATGAAGATACTCACA & R：CAGGATACGGGGAGCTAAT。每組實驗重復3次。

1.2.6 葉綠素熒光參數(shù)分析 葉綠素熒光參數(shù)測定采用飽和脈沖分析方法，數(shù)據(jù)采集通過葉綠素熒光成像系統(tǒng)IMAG-MINI（德國）。植物首先暗處理30 min，打開測量光，記錄暗處理后初始熒光值Fo；打開飽和脈沖并持續(xù)0.8 s，測得暗處理后最大熒光值Fm；關閉飽和脈沖，打開光化光，記錄葉綠素熒光從黑暗到光照的響應過程，等熒光曲線趨于穩(wěn)定時關閉光化光，打開飽和脈沖0.7秒，此時測得葉綠素熒光峰值Fm'。光系統(tǒng)II的最大光效率Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm；非光化學淬滅值NPQ=（Fm/Fm'）- 1。

1.2.7 抗氧化系統(tǒng)活力測定 取500 mg葉片于5 mL提取液［含25 mmol/L PBS，0.2 mmol/L EDTA，2 mmol/L抗壞血酸和2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）pH7.8］中研磨。12 000 r/min低溫離心20 min，取上清液用來檢測抗氧化酶活性。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶（Guaiacol peroxidase，GPX）和抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）活性檢測方法參照Xu等［17］的文章。

1.2.8 植物氧化損傷分析 超氧化物用0.5 mg/mL硝基氯化四氮唑藍（Nitro blue tetrazolium，NBT）染色2 h。過氧化氫用2 mg/mL 3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）染色8 h。

葉片相對含水量RWC=（Fw-Dw）/（Tw-Dw）×100%。其中Fw代表葉片濕重；Dw代表葉片干重；Tw代表葉片飽和吸水重量。

電導率（Electrolyte leakage，EL）表示植物細胞質膜的透性，檢測方法如下：取0.5 g新鮮葉片，洗凈后用剪刀將其剪碎，加入5 mL超純水后真空抽濾20 min，在室溫下靜置1 h，用電導率儀器測試電導率Ri。然后沸水浴中煮5 min，冷卻到室溫然后再測定電導率Rt，相對電導率Ro=Ri/Rt。

丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量可以用來表示細胞脂質過氧化情況，其定量方法參考Deng等［9］文章。

2 結果

2.1 高溫脅迫下BR激活交替呼吸途徑

為了探索高溫逆境下BR與交替呼吸途徑之間的關系，首先檢測了BR處理后本氏煙交替呼吸的變化情況。結果顯示在正常生長條件下，與對照組（水處理）相比植株在噴施BL后交替呼吸強度顯著上調，NbAOX1表達量也表現(xiàn)出明顯上升。在化學試劑處理 12 h后，將植株移至37℃生長條件下，并連續(xù)檢測了其交替呼吸及AOX1表達量隨時間的變化。如圖1所示，高溫逆境條件下生長的植物，其抗氰呼吸、AOX1基因表達水平高于正常生長條件下的植株；這種趨勢在BL處理后更為顯著。這些結果說明BR能夠誘導植物AOX途徑以響應高溫逆境。

圖1 BR誘導交替呼吸Valt及NbAOX1表達量隨時間的變化

2.2 BR誘導的交替途徑減高溫緩脅迫對光系統(tǒng)的損傷

為了進一步分析交替呼吸途徑在BR介導的植物抗高溫中的功能，我們通過葉綠素熒光成像系統(tǒng)分析了熱脅迫下植物光系統(tǒng)II的功能。如圖2所示，正常生長條件下，對照組與處理組植株光系統(tǒng)II參數(shù)無明顯差別。在高溫脅迫下，噴施BL的植株其光系統(tǒng)II的最大光效率Fv/Fm比水處理植株高（圖2-A-B）。相反，BL處理植株非光化學淬滅值NPQ比水處理植株低（圖2-C-D）。然而，BL處理對植物光系統(tǒng)的保護作用在交替途徑抑制劑SHAM存在時會受到抑制。為了進一步分析AOX1對BR誘導植物抗逆的影響，用VIGS技術沉默了NbAOX1基因。與SHAM共處理相似，在高溫處理下，NbAOX1沉默植株中噴施BR不能夠明顯上調Fv/Fm及下調NPQ（圖2）。這些結果證明BR誘導的交替途徑能夠在逆境中保護植物光系統(tǒng)。

圖2 交替呼吸途徑參與BR緩解植物在逆境中的光系統(tǒng)損傷

2.3 高溫逆境下BR誘導的交替途徑減輕ROS的積累

植物在響應逆境脅迫時往往會伴隨著ROS的積累。本研究用NBT及DAB染色法檢測了植株中超氧化物及過氧化氫的含量。這兩種方法都檢測到脅迫條件下ROS積累明顯變多，而BR處理會在一定程度上降低ROS的積累。然而在SHAM預處理或NbAOX1沉默植株中，BR緩解ROS積累的情況受到顯著抑制（圖3-A-B）。

組織的電導率（EL）、MDA及相對含水量（RWC）這些生理指標被常用來表現(xiàn)植物在逆境中受到氧化損傷的情況。與ROS積累相似，高溫脅迫能夠導致植株EL及MDA含量上升。與水處理植株相比，BL處理植株表現(xiàn)出更低水平的細胞死亡、EL及MDA含量（圖3-C-D）。植物在逆境中RWC會明顯降低，而在相同條件下，BL處理后的植株中RWC明顯高于水處理植株（圖3-E）。然而，熱脅迫處理后BR對以上3個生理參數(shù)的調控作用在SHAM共處理或NbAOX1沉默植株中會受到抑制。

2.4 高溫逆境下交替呼吸途徑對BR激活本氏煙抗氧化系統(tǒng)的影響

植物中抗氧化系統(tǒng)能夠減緩植物在逆境下所受的氧化損傷。本研究也檢測了4種抗氧化酶活性的變化情況，包括：超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、抗壞血酸過氧化物酶APX和愈創(chuàng)木酚過氧化物酶GPX。如圖4所示，在正常生長條件下，對照組與處理組植株抗氧化酶活性無明顯差別。在熱脅迫處理后，抗氧化酶活性明顯上調，而這些上調在噴施BL植株中要強于噴施水的植株。有趣的是，SHAM處理或沉默NbAOX1基因能夠抑制BR激活這4種抗氧化酶的活性。

圖3 交替呼吸途徑參與BR緩解高溫逆境對植物造成的氧化損傷

圖4 高溫逆境下交替呼吸途徑參與BR激活本氏煙抗氧化酶活性

3 討論

有關交替呼吸途徑在植物響應逆境方面調控的研究越來越多，在過去十幾年內，人們發(fā)現(xiàn)AOX可能是線粒體調控植物抗逆的重要成員之一。許多逆境脅迫如冷脅迫、干旱脅迫、鹽脅迫等都能誘導植物抗氰呼吸、AOX轉錄及蛋白水平上調［11，17-18］。有研究報道植物激素能夠誘導交替呼吸途徑。在煙草中，低濃度的水楊酸能夠誘導AOX基因表達及抗氰呼吸［19］。植物響應逆境時乙烯信號常常與交替呼吸途徑存在多重交叉影響［12，17］。這些研究都說明植物中交替途徑與植物激素間存在一定聯(lián)系。本研究證明了在本氏煙草中BR也能夠誘導交替途徑，外施BR能夠誘導植物抗氰呼吸及NbAOX1基因轉錄水平，這些結果為BR與交替呼吸途徑之間存在關聯(lián)提供了證據(jù)。有意思的是，BR對交替呼吸途徑的誘導作用在高溫逆境下尤為顯著，這暗示了交替途徑可能參與BR調控植物響應高溫逆境的過程。事實上，實驗結果也證明了交替呼吸途徑在BR誘導植物對熱脅迫抗性的過程中發(fā)揮了重要作用。無論是通過化學試劑處理還是基因沉默方法抑制交替呼吸途徑后，高溫逆境下BR處理對煙草光合系統(tǒng)的保護能力受到了一定程度的抑制。

BR誘導的交替呼吸途徑很可能在某種程度上緩解了高溫逆境下ROS的過量積累。一般來說，AOX能夠通過降低植物線粒體內泛醌的含量從而抑制ROS的合成［20-21］。已有研究報道了過表達AOX基因能夠降低植物中ROS的含量［22-23］，植物缺失AOX基因后在逆境下會遭受更大程度的傷害［24］。在本研究中，抑制交替途徑后BR處理植株在熱脅迫條件下仍能積累大量ROS。逆境下抗氧化系統(tǒng)能夠清除過多的ROS從而保護植物免受氧化傷害。在本實驗中，抑制交替途徑對BR在抗氧化酶活性調控方面起到了負面的影響。同樣，脅迫損傷指標檢測發(fā)現(xiàn)在抑制交替途徑的植株中，BR處理不能有效地減緩植物遭受的逆境損傷。這些結論都說明在高溫逆境下，交替呼吸途徑能夠幫助BR激活植物抗氧化系統(tǒng)來緩解植物的氧化損傷。

4 結論

在高溫逆境下，交替呼吸途徑能夠被BR信號激活，被激活的交替途徑能夠抑制植物在逆境中ROS的過量積累及保護光系統(tǒng)。本研究證實了交替呼吸途徑參與BR調控植物響應逆境信號，同時也為BR信號在調控植物抗逆方面的研究提供了新的證據(jù)。