馬瑞景，張晴雯，龔霞，徐亞飛，袁文雅

(湖北大學生命科學學院， 湖北 武漢 430062)

0 引言

B3結構域蛋白是植物特有的一類轉錄因子家族，擬南芥中該家族成員至少含有87個成員，分為5個家族：Abscisic acid-insensitive 3 (ABI3)，High level expression of sugar inducible (HSI)，Auxin response fator (ARF)，Related to ABI3/VP1 (RAV)和Reproductive meristem(REM)家族[1].在這5個家族中，關于ARF和RAV家族的研究較多，ABI3次之，近年來關于HSI家族的研究也日益增多.但是，對REM家族的研究較少，可能與家族成員繁多或存在冗余有關.不同的家族成員之間，B3結構域的DNA結合特異性也不同.ABI3和HSI家族成員的B3結構域可以識別Sph/RY元件的CATGCA序列[2]，ARF家族成員的N端B3結構域可以識別TGTCTC序列[3]，RAV家族成員的C端B3結構域可以識別CACCTG序列[4].由于其結合的基因序列不同，這暗示著不同家族可能參與生理過程也不同.

HSI家族成員又名為Viviparous 1/Abscisic acid insensitive-like(VAL)家族，是一類植物特異性的含B3結構域的轉錄抑制因子，除B3結構域外，還含有PHD (plant homeodomain)結構域、Zf-CW (zinc finger-cysteine and tryptophan residue-containing domain)結構域和EAR (ethylene-responsive element binding factor-associated amphiphilic repression) motif.VALs家族有3個成員，分別命名為VAL1，VAL2，VAL3，由于VAL3含有不完整的PHD結構域且苗期表達量很低，目前主要的研究是針對VAL1及VAL2.VAL1通過EAR motif與MEDIATOR CDK8模塊的MED13的TRAP240結構域結合，通過Zf-CW motif與HDA6結合，使VAL1、MED13和HDA6形成復合體，直接結合到種子成熟基因的5’編碼區(qū)，直接抑制擬南芥子葉中種子成熟基因的表達和脂肪酸的合成[5].Zf-CW結構域已經(jīng)被證明是組蛋白標記的reader，能夠特異地識別H3K4me2和H3K4me3[6]；而PHD結構域也能與H3K4me3結合[7]，這些證據(jù)表明VAL1可能通過調(diào)節(jié)組蛋白H3K9去乙?；虷3K4甲基化來調(diào)節(jié)下游基因的表達.同時，也有研究證明VAL1和VAL2能夠與FLC的CME元件(含Sph/RY motif)結合，招募PRC2復合體的LHP1到FLC染色質上使其組蛋白H3K4發(fā)生三甲基化，從而影響開花[8].

前期研究結果顯示VALs蛋白主要通過B3結構域結合靶基因，并通過PHD、Zf-CW和EAR等結構域招募染色質修飾因子，抑制靶基因的表達.為了進一步揭示VALs蛋白抑制靶基因表達的分子機制，本研究擬通過酵母雙雜技術篩選擬南芥的轉錄因子文庫，獲得一些與VALs蛋白直接互作的轉錄因子，為后續(xù)深入研究VALs蛋白發(fā)揮生物學功能的分子機制提供研究方向及基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料擬南芥野生型材料Col和酵母菌株AH109均來自本實驗室，擬南芥轉錄因子文庫來自北京大學瞿禮嘉老師團隊[9].

1.2 實驗方法

1.2.1 VAL1與VAL2基因序列的分析及擴增 在TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/)上查找VAL1和VAL2的CDS序列，設計引物；選取四葉期左右的嫩葉，用Trizolup (TransGen Biotech, Cat. No. ET111-01)提取擬南芥野生型Col的總RNA，之后用M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen, Cat. No. 28025013) 反轉錄，以此為模板PCR擴增出基因序列，并測序驗證.

1.2.2 Bait載體的構建 Gateway方法獲得含VAL1、VAL2基因的Bait載體：在引物5’端加入attB序列，PCR擴增出帶attB位點的基因序列(引物序列見表1)，通過BP反應重組進入中間載體pDONR 201，再通過LR反應克隆進入最終載體pDEST 32形成Bait載體.BP反應體系：0.5 μL BP ClonaseTMII (Invitrogen)、0.5 μL pDONR201 (100 ng/μL左右)、3 μL attB-PCR product (50 ng/μL)、1 μL ddH2O；室溫反應1 h，在反應體系中加0.5 μL 蛋白酶K于37 ℃水浴鍋中孵育10 min，熱激法轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞涂布于卡那霉素平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h.LR反應體系：0.5 μL LR ClonaseTMII (Invitrogen)、0.5 μL pDEST32 (100 ng/μL左右)、3 μL attL1 and attL2 Entry clone (50 ng/μL)、1 μL ddH2O；后續(xù)反應條件和轉化方法操作同BP反應.

表1 本實驗所用主要引物

1.2.3 Bait菌株的構建及自激活驗證 構建的Bait質粒經(jīng)測序驗證后轉入酵母AH109中：挑取新鮮的AH109單菌落搖培制成酵母感受態(tài)，加入50% PEG4000 240 μL、1 mol/L LiAc 34 μL和Bait質粒200 ng左右，混勻42 ℃水浴2 h離心取上清加水稀釋涂布于亮氨酸缺陷型平板，28 ℃培養(yǎng)2～3 d得到轉化菌株，陽檢后獲得Bait菌株.將兩個Bait質粒與Prey空質粒pDEST22分別共轉化進入酵母感受態(tài)AH109，涂布在SD/-Leu-Trp二缺培養(yǎng)基中，再分別挑取十幾個共轉化單菌落于200 μL ddH2O中，渦旋混勻后稀釋10倍，用移液器吸取5～8 μL點在SD/-Leu-Trp二缺和SD/-Leu/-Trp /-His/-Ade四缺平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d比較共轉化菌株在二缺和四缺培養(yǎng)基的生長狀況，驗證重組蛋白表達是否存在自激活現(xiàn)象.

1.2.4 擬南芥酵母轉錄因子文庫的篩選 將Bait菌株搖菌培養(yǎng)至OD600約0.8左右，在2 mL 96孔深孔板中先加入200 μL YPDA培養(yǎng)基，然后加入30 μL Bait菌株，再加入30 μL事先融化的擬南芥酵母轉錄因子文庫作為Prey菌株，蓋上配套的硅膠蓋，用保鮮膜封好，放入28 ℃搖床中50 r/min輕搖24 h左右；在每個孔中加入1 mL滅菌的ddH2O，然后吸取5～8 μL輕點在SD/-Leu-Trp二缺和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade四缺平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d觀察實驗結果.

2 結果與分析

2.1 VAL1與VAL2基因序列和蛋白質序列的分析VAL1基因序列號為AT2G30470，全長基因組序列為4 850 bp，選取AT2G30470.1轉錄本進行序列分析和后續(xù)載體構建，編碼區(qū)有2 373 bp，包括12個外顯子和11個內(nèi)含子，編碼氨基酸790aa；VAL2基因序列號為AT4G32010，全長基因組序列為5 976 bp，選取代表性轉錄本AT4G32010.1進行序列分析和后續(xù)實驗，編碼區(qū)有2 343 bp，也包括12個外顯子和11個內(nèi)含子，編碼氨基酸780aa，全長基因組序列結構圖如圖1A和圖1B.VAL1和VAL2的蛋白質長度相近，經(jīng)過InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/)和Xfam (http://xfam.org)在線網(wǎng)址和相關文獻鑒定兩者的蛋白質結構，結果顯示，VAL1和VAL2的結構也相同,都可以分為PHD結構域、B3結構域、CW結構域和EAR結構域[10]，蛋白質結構圖見圖1C.PHD結構域是植物特有的一類含鋅指結構的同源結構域，可以識別組蛋白修飾H3K4me3和K3K27me2以及H3K27me3，破壞VAL1的PHD結構域會導致種子相關基因富集的H3K4me3增加、K3K27me2和H3K27me3減少，使得這些基因在植物幼苗階段異位表達影響植物的正常生長[11].B3結構域是DNA結合結構域，可以識別基于CATGCA序列的Sph/RY元件[2].CW結構域也能夠識別組蛋白H3K4me2和H3K4me3，VAL2的CW結構域能夠和組蛋白去乙?；窰DA19結合改變種子成熟基因的組蛋白乙?；绞蛊浔磉_量下調(diào)[12].EAR結構域是能夠招募如SIN3 (SWI-independent 3)和TPL (TOPLESS)等共抑制因子的一種抑制結構域，之后可以招募組蛋白去乙?；笍秃象w到靶基因上[13].

A和B分別是VAL1和VAL2的基因結構圖，橫線表示非編碼區(qū)和內(nèi)含子，白色方框表示5’UTR和3’UTR，黑色方框表示編碼區(qū)及外顯子；C為VAL1和VAL2的蛋白質結構示意圖圖1 VAL1和VAL2的基因結構圖及蛋白質結構圖

PCR擴增后產(chǎn)物的電泳膠圖,泳道1：VAL1；泳道2：VAL2；泳道3：Marker圖2 VAL1和VAL2的基因擴增圖

2.2 VALs Bait載體的構建取擬南芥野生型Col的嫩葉用Trizol試劑提取總RNA，經(jīng)過反轉錄酶反轉錄之后合成第一鏈cDNA.根據(jù)VALs基因序列設計引物，在引物5’端加上含attB位點的序列(上游引物5’端添加序列：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC；下游引物5’端添加序列：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTT)合成引物.以反轉錄的cDNA為模板，用上述設計的引物進行PCR反應擴增出含attB位點的VAL1和VAL2的基因序列，基因擴增條帶見圖2，PCR產(chǎn)物送公司測序驗證序列正確.

構建質粒載體有多種方法，本實驗中所用到的擬南芥轉錄因子文庫中Prey菌株所含的載體為pDEST 22，與之進行酵母雙雜實驗的配套Bait載體為pDEST 32.pDEST 22及pDEST 32載體為Gateway同源重組系統(tǒng)，所以將帶attB位點的VAL1和VAL2基因經(jīng)BP重組反應克隆到中間載體pDONR 201創(chuàng)建出entry clone：pDONR-201-VAL1和pDONR-201-VAL2，再經(jīng)LR重組反應克隆到最終載體pDEST 32中成為expression clone：pDEST 32-VAL1和pDEST 32-VAL2，當中兩次克隆均需挑陽性克隆送測序驗證完全正確(Gateway技術原理示意見圖3).

A為BP反應示意圖； B為LR反應示意圖圖3 Gateway技術原理示意圖[14]

W:Trp 色氨酸；L：Leu 亮氨酸；H：His 組氨酸；A：Ade 腺嘌呤圖4 VAL1及VAL2的自激活驗證

圖5 VAL2與HD ZIP IV家族5個成員的酵母互作圖

2.3 VALs Bait菌株的構建及自激活驗證和毒性檢測將測序驗證完全正確的兩個Bait質粒轉入酵母AH109菌株，進行酵母菌落PCR篩選陽性克隆，將陽性克隆命名為Bait菌株B-VAL1和B-VAL2，配置50%甘油-80 ℃凍存菌株.在進行酵母雙雜交之前，Bait菌株需進行自激活驗證和毒性檢測.自激活驗證是為了確認Bait是否能自動激活菌株里的報告基因，可以采用將Bait菌株活化后直接涂布在加入X-α-Gal或Aureobasidin A抗生素的SD/-Leu單缺平板上，或者直接涂布在SD/-Leu-Trp二缺培養(yǎng)皿上.我們采用的是將Bait質粒和Prey空質粒pDEST22共轉進入AH109直接涂布在二缺培養(yǎng)皿上，再將共轉的菌株點在二缺和四缺平板上觀察3～5 d后發(fā)現(xiàn)兩個菌株在二缺上都能生長，在四缺上都不能生長，表明它們都不存在自激活現(xiàn)象(見圖4).毒性檢測是要檢測該表達蛋白是否會影響酵母的生長，如果Bait菌株在單缺培養(yǎng)基的搖培過程中發(fā)現(xiàn)生長異常緩慢，說明該菌株有毒性效應，本實驗中B-VAL1和B-VAL2無論在固體還是液體培養(yǎng)基中均能夠正常生長.

2.4 擬南芥酵母轉錄因子文庫的篩選酵母雙雜實驗的原理是轉錄因子Gal4含有一個DNA結合結構域(binding domain，BD)和一個激活結構域(active domain，AD)，將其分別連在兩個載體上，在這兩個載體上分別接上Bait基因以及Prey基因；當兩個載體轉入一個菌株時，若這兩個載體表達的蛋白質能夠發(fā)生相互作用，AD和BD接近能夠起到轉錄因子的作用激活菌株中的報告菌株，從而能夠在營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基上正常生長.在本實驗中，Bait菌株是AH109，轉錄因子文庫作為Prey菌株是Y187，這兩種菌株能夠通過Mate接合生殖生成同時含Bait及Prey兩種質粒的新的菌株來驗證兩個蛋白質是否能發(fā)生相互作用.擬南芥酵母轉錄因子文庫共有14個96孔深孔板(P1～P14)，包含1 344個Prey菌株，覆蓋了擬南芥的大部分轉錄因子；我們分兩批進行了兩次重復的酵母雙雜實驗后篩選到了與VAL2能夠發(fā)生相互作用的菌株有6個，分別為P7B7、P12H9、P12H10、P12H11、P13C9、P13C10.其中，兩次重復都能鑒定到的基因有5個，分別為AT4G04890、AT1G05230、AT5G46880、AT1G73360、AT1G17920，基因名分別為PDF2、HDG2、HDG5、HDG11、HDG12(https://www.arabidopsis.org/)，都為HD-ZIP IV家族的轉錄因子.將這5個基因對應的酵母菌株挑出來單獨與B-VAL2(pDEST-32-VAL2)進行點對點Mate實驗驗證，結果顯示VAL2確實與PDF2、HDG2、HDG5、HDG11及HDG12這5個蛋白存在相互作用(圖5).另外，本次實驗中并未篩選到能夠與VAL1發(fā)生相互作用的蛋白質，但這并不意味著VAL1沒有能與之互作的轉錄因子.

3 討論與展望

3.1 酵母雙雜交實驗技術的優(yōu)劣酵母雙雜交實驗是體外驗證蛋白質互作的最經(jīng)典、最快速的實驗方法.當我們沒有已轉化目標檢測蛋白的擬南芥轉化植株，但是又想要先快速檢測一下兩種蛋白質是否能潛在地發(fā)生互作時，首選的是用時最短的酵母雙雜實驗.但是，除了酵母雙雜交外，我們還需要利用其他的實驗技術同時從體外體內(nèi)兩方面進行驗證，比如BiFC、pull-down、Co-IP等技術.多種實驗同時做出有互作的陽性結果才能最終確認這兩個蛋白質存在相互作用.酵母雙雜交可能存在假陰性或者假陽性，比如已發(fā)表的文獻中做出某兩個蛋白有相互作用時，但是我們并沒有陽性結果，此時可能需要多重復幾次實驗或者進行其他實驗驗證；有時酵母雙雜交實驗有陽性結果，但是用更準確的體內(nèi)實驗驗證并沒有互作時，一方面可能是酵母實驗存在假陽性，另一方面可能是這兩個蛋白質只在體外互作，在植物體內(nèi)并不發(fā)生互作.為了減少酵母假性實驗結果，通常需要對Bait進行表達檢測、自激活驗證以及毒性檢測，檢測Bait重組蛋白是否能夠成功表達，可以用GAL4 DNA-BD單克隆抗體或c-Myc單克隆抗體進行Western blot實驗，通常實驗中一般可以忽略這一步.我們后續(xù)將用其他技術繼續(xù)驗證VAL2與HD ZIP IV家族5個成員是否確實能在體外和體內(nèi)互作參與某些生理過程，同時繼續(xù)篩選與VAL1能發(fā)生互作的蛋白質.

3.2 HD-ZIP IV家族轉錄因子HD-ZIP指homeodomain-leucine zipper轉錄因子家族，HD-ZIP IV家族是該家族第四個亞族，共有16個成員，分別為HDG1-HDG12、GL2、ANL2、ATML1、PDF2.GUS啟動子融合表達分析顯示，HDG2、HDG5、HDG11、HDG12、ATML1、PDF2主要表達于莖分生組織和器官的表皮層，這表示HD-ZIP IV家族的許多成員可能參與調(diào)節(jié)表皮的基因表達.而這16個基因的突變體中，只有少數(shù)幾個突變體有明顯的表型性狀.hdg2突變體的表皮毛(trichome)具有光滑的細胞壁[15]，hdg11突變體的表皮毛分支增多且hdg11hdg12雙突變體相對于hdg11單突變體表型明顯增強[16].PDF2和ATML1的序列相似，并且都表達在莖尖分生組織的最外層L1層，它們的單突變體都沒有明顯的表型，但是雙突變體在莖表皮細胞分化方面有著嚴重的缺陷，說明它們功能冗余且十分關鍵[17].同時，pdf2分別和hdg2、hdg5、hdg12的雙突變體的花異常，表現(xiàn)為萼片花瓣和心皮雄蕊異常，這可能與花瓣和雄蕊識別基因APETALA 3 (AP3)的下調(diào)有關[18].這表明HD-ZIP IV家族不僅參與莖尖分生組織的發(fā)育，同時也參與花器官的形成，而VALs轉錄因子也參與幼苗早期生長和花期的調(diào)控[5, 8]，說明VALs極有可能與HD-ZIP IV發(fā)生互作共同調(diào)控這兩個階段的發(fā)育.后續(xù)我們可以通過其他蛋白質互作技術繼續(xù)驗證VAL2與HD-ZIP IV家族的互作，同時尋找其突變體或采用CRISPR基因編輯技術敲除并觀察雙突變體或多突變體的表型，進而研究該互作在植物生長發(fā)育過程中起到的功能與意義.