肖二輝, 寧會彬， 康月花， 殷 輝， 馬 力, 毛重山， 趙 巖， 尚 佳

1 河南省人民醫(yī)院 感染科， 鄭州大學人民醫(yī)院， 河南大學人民醫(yī)院， 鄭州 450003；2 阜外華中心血管病醫(yī)院 急診科， 河南省人民醫(yī)院 心臟中心， 鄭州 450003

肝癌是常見的惡性實體腫瘤，其惡性程度高、發(fā)展速度快，嚴重威脅著人類的生命健康[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種沒有編碼蛋白質(zhì)功能的小分子RNA，其在人體組織中廣泛表達，miRNA在腫瘤進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，miRNA異常表達與腫瘤細胞的惡性生長和凋亡有關(guān)，探討miRNA在腫瘤中的作用對于靶向基因治療腫瘤具有重要意義[2]。目前已知miR-196b在結(jié)直腸癌、白血病等腫瘤中異常高表達，在腫瘤進展中可能發(fā)揮促進作用[3-4]。既往研究[5]顯示，miR-196b在肝癌中表達上調(diào)，而對于miR-196b在肝癌細胞增殖凋亡中的作用還不清楚。本次實驗探討下調(diào)miR-196b對肝癌細胞增殖、克隆和凋亡的影響和靶向調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細胞HuH-7、SNU-449、HepG2和人正常肝細胞HL7702均購自美國ATCC；肝癌細胞SMCC7721購自中國科學院上海細胞庫；miRNA cDNA合成試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；inhibitor control、miR-196b inhibitor、miR-196b mimics、mimics control由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；野生型(wild type，WT)和突變型(mutant，MUT)熒光素酶報告載體由南京科佰生物科技有限公司構(gòu)建；核凋亡誘導因子1(nuclear apoptosis-inducing factor 1，NAIF1) siRNA、siRNA control由上海銳賽生物技術(shù)有限公司合成；Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗體、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，C-caspase-3)抗體購自碧云天生物技術(shù)研究所；NAIF1抗體購自美國Santa Cruz。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR檢測miR-196b在肝癌細胞中的表達變化 收集肝癌細胞HuH-7、SNU-449、HepG2、SMCC7721和人正常肝細胞HL7702，添加Trizol試劑，提取細胞中的總RNA，紫外分光光度法測定濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄體系為： primer mi×0.5 μl、RT primer 0.5 μl、5×RT Buffer 2 μl、RTase 0.5 μl、RNA 2.5 μl，添加二乙基焦磷酰胺水至10 μl，反轉(zhuǎn)錄條件為：16 ℃孵育30 min，42 ℃孵育90 min，72 ℃孵育5 min。Real-time PCR體系如下:2×Real-time PCR Master Mix 5 μl、上下游引物各0.2 μl、cDNA 2.5 μl，然后添加ddH2O至10 μl。Real-time PCR反應條件為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。U6為內(nèi)參，按照2-△△Ct法計算miR-196b表達變化。引物為：U6-F，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6-R，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-196b-F，5′-CGGCGGTAGGTAGTTTCCTGTT-3′，miR-196b-R，5′-CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染和分組 取肝癌細胞HepG2，分成3組，分別為Control、Anti-NC、Anti-miR-196b組，Anti-NC、Anti-miR-196b為轉(zhuǎn)染inhibitor control、miR-196b inhibitor的細胞，Control為沒有轉(zhuǎn)染的細胞。細胞轉(zhuǎn)染步驟同Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑。細胞轉(zhuǎn)染后48 h，利用Real-time PCR方法測定miR-196b表達變化(步驟同1.2.1)。

1.2.3 噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)檢測下調(diào)miR-196b對肝癌細胞增殖的影響

收集轉(zhuǎn)染后的Control、Anti-NC、Anti-miR-196b組細胞，接種到96孔板，每個孔中加5000個細胞，培養(yǎng)48 h后，進行MTT檢測。步驟如下：在每個孔內(nèi)加入20 μl的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，把孔內(nèi)的液體吸棄，添加150 μl的二甲基亞砜，搖床孵育震蕩10 min，測定570 nm的吸光度值(A值)，用不含細胞孔的檢測值進行調(diào)零。

1.2.4 平板克隆實驗檢測下調(diào)miR-196b對肝癌細胞克隆能力影響 收集轉(zhuǎn)染以后的Control、Anti-NC、Anti-miR-196b組細胞，接種到細胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)14 d，出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆團，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計數(shù)克隆形成數(shù)目。

1.2.5 流式細胞儀檢測下調(diào)miR-196b對肝癌細胞凋亡的影響 收集轉(zhuǎn)染48 h后的Control、Anti-NC、Anti-miR-196b組細胞，添加PBS洗滌2次，將細胞懸浮于400 μl的結(jié)合緩沖液中，添加膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)、碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色液各5 μl，避光反應20 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 Western Blot檢測下調(diào)miR-196b對肝癌細胞中NAIF1、Bax、C-caspase-3蛋白表達的影響 收集轉(zhuǎn)染48 h后的Control、Anti-NC、Anti-miR-196b組細胞，提取細胞蛋白。按照BCA方法測定蛋白的濃度。70 V電壓電泳至溴酚藍染料進入分離膠和濃縮膠的邊緣，然后把電壓調(diào)整到120 V繼續(xù)電泳。設(shè)置100 V的電壓轉(zhuǎn)膜2 h。PVDF膜放在5%牛血清白蛋白溶液中孵育封閉2 h，然后放在一抗稀釋液中在4 ℃過夜，最后將PVDF膜放在二抗稀釋液中孵育2 h。二抗以1∶4000稀釋，NAIF1、Bax、C-caspase-3抗體稀釋倍數(shù)分別為1∶1000、1∶800、1∶600。滴加ECL顯色試劑，Image J分析條帶灰度值，β-actin作為內(nèi)參，分析蛋白表達變化。

1.2.7 靶基因預測和鑒定 利用生物信息學軟件targetscan預測miR-196b的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-196b同NAIF1的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated regions,3′UTR)端有互補結(jié)合位點，構(gòu)建含有3′UTR端結(jié)合位點的WT熒光素酶報告載體，同時構(gòu)建突變以后不含3′UTR端結(jié)合位點的MUT熒光素酶報告載體，將WT、MUT分別同miR-196b mimics、mimics control轉(zhuǎn)染到肝癌細胞HepG2中，48 h后，用熒光素酶活性檢測試劑盒測定細胞熒光素酶活性變化。

1.2.8 NAIF1 siRNA對下調(diào)miR-196b調(diào)控肝癌細胞增殖、克隆、凋亡的影響 將miR-196b inhibitor、NAIF1 siRNA和miR-196b inhibitor、siRNA control分別共轉(zhuǎn)染到肝癌細胞HepG2中，命名為Anti-miR-196b+si-NAIF1和Anti-miR-196b+si-NC，將NAIF1 siRNA和siRNA control分別轉(zhuǎn)染到肝癌細胞HepG2中，記為si-NC和si-NAIF1，按照上述MTT、平板克隆、流式細胞儀、Western Blot方法測定細胞增殖、克隆、凋亡和NAIF1、Bax、C-caspase-3蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1 miR-196b在肝癌細胞中表達上調(diào) 肝癌細胞HuH-7、SNU-449、HepG2、SMCC7721中miR-196b水平明顯高于人正常肝細胞HL7702(P值均<0.05)(表1)，提示miR-196b在肝癌細胞中表達上調(diào)。

表1 肝癌細胞HuH-7、SNU-449、HepG2、SMCC7721和人正常肝細胞HL7702中miR-196b表達的比較

2.2 miR-196b inhibitor下調(diào)肝癌細胞中miR-196b表達水平 與Anti-NC組比較，Anti-miR-196b組肝癌細胞中miR-196b表達水平明顯降低(P<0.05)(表2)，提示miR-196b inhibitor下調(diào)肝癌細胞中miR-196b表達水平。

表2 miR-196b inhibitor轉(zhuǎn)染后肝癌細胞中miR-196b水平比較

2.3 下調(diào)miR-196b對肝癌細胞增殖、克隆和凋亡影響

與Anti-NC組比較，Anti-miR-196b組肝癌細胞A值、克隆形成數(shù)目均明顯下降，細胞凋亡率和細胞中Bax、C-caspase-3蛋白表達水平均明顯升高(P值均<0.05)(圖1，表3)，提示下調(diào)miR-196b抑制肝癌細胞增殖、克隆并誘導細胞凋亡。

表3 miR-196b inhibitor轉(zhuǎn)染后肝癌細胞A值、克隆形成數(shù)目、凋亡率和Bax、C-caspase-3蛋白相對表達量比較

2.4 miR-196b靶向負調(diào)控NAIF1表達 利用生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-196b同NAIF1的3′UTR端有互補結(jié)合位點，熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定結(jié)果顯示NAIF1為miR-196b的靶基因；與Anti-NC組比較，Anti-miR-196b組肝癌細胞NAIF1蛋白表達水平升高(P<0.05)(圖2，表4、5);提示miR-196b靶向負調(diào)控NAIF1表達。

表4 熒光素酶活性變化

表5 miR-196b inhibitor轉(zhuǎn)染后肝癌細胞中NAIF1蛋白水平比較

2.5 NAIF1 siRNA逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-196b對肝癌細胞增殖、克隆和凋亡影響 與Anti-miR-196b+si-NC組比較，Anti-miR-196b+si-NAIF1組肝癌細胞A值升高，克隆形成數(shù)目增加，細胞凋亡率降低，NAIF1、Bax、C-caspase-3蛋白水平也下降(P值均<0.05)；與si-NC組比較，si-NAIF1組肝癌細胞A值升高，克隆形成數(shù)目增加，細胞凋亡率降低，NAIF1、Bax、C-caspase-3蛋白水平也下降(P值均<0.05)(圖3,表6)。

表6 NAIF1 siRNA和miR-196b inhibitor共轉(zhuǎn)染后肝癌細胞A值、克隆形成數(shù)目、凋亡率和NAIF1、Bax、C-caspase-3蛋白相對表達量比較

3 討論

miRNA不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，參與多種生理過程，miRNA還與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，在腫瘤進展中扮演促進作用或抑制作用[6-8]。miR-196b是一個多功能調(diào)節(jié)因子，在脂肪細胞分化、骨髓生成中具有調(diào)控作用[9-10]。近年來的研究[11]顯示，miR-196b與肺癌等腫瘤有關(guān)，其在腫瘤中高表達。研究[5]表明，miR-196b在肝癌組織中高表達，其在肝癌進展中可能發(fā)揮促進作用。本次研究發(fā)現(xiàn)，miR-196b在肝癌細胞中的表達水平升高，下調(diào)miR-196b后的肝癌細胞的增殖和克隆能力下降，這可能提示，miR-196b在肝癌進展中發(fā)揮促進作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-196b后的肝癌細胞凋亡水平增加，提示下調(diào)miR-196b具有誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡的作用。細胞凋亡減少是腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)，而細胞凋亡發(fā)生是一個復雜的基因調(diào)控過程，與細胞內(nèi)的多種蛋白、因子表達改變有關(guān)[12]。Bcl-2和caspase蛋白家族是目前研究較多的與細胞凋亡相關(guān)的調(diào)控蛋白，在細胞凋亡過程中分別發(fā)揮促進和抑制作用[13-14]。Bax是Bcl-2蛋白家族成員，具有促進細胞凋亡進程的作用[15]。caspase-3是caspase蛋白家族的成員，只有其被剪切活化后才可以發(fā)揮促進凋亡的作用，并且caspase-3活化是細胞凋亡進入不可逆階段的標志[16]。本次實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-196b可以促進肝癌細胞中Bax和C-caspase-3蛋白表達，進而誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡，這與細胞凋亡檢測結(jié)果一致。

miRNA發(fā)揮生物學功能與靶向影響下游基因的表達有關(guān)，其可以與靶基因的3′UTR端互補結(jié)合，從而抑制蛋白翻譯，同一個miRNA可能同時具有多個靶基因，分別可能在不同的病理或生理過程中發(fā)揮作用[17-18]。miR-196b參與腫瘤進展與靶向調(diào)控基因的表達有關(guān)。本次的實驗表明，miR-196b可以靶向負調(diào)控NAIF1表達。NAIF1是一個與細胞凋亡有關(guān)的基因，具有誘導細胞凋亡的作用[19]。NAIF1在胃癌、肝癌等腫瘤組織中異常低表達，而上調(diào)NAIF1表達可以抑制肝癌細胞的增殖能力[20-22]。本實驗表明，下調(diào)NAIF1可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)miR-196b對肝癌細胞抑制增殖和促進凋亡的作用，這提示miR-196b通過靶向調(diào)控NAIF1表達參與肝癌細胞生長和凋亡。

總之，miR-196b在肝癌細胞中高表達，并且在肝癌的進展過程中發(fā)揮促進作用，而下調(diào)miR-196b通過靶向負調(diào)控NAIF1抑制肝癌細胞生長并誘導細胞凋亡，這提示靶向miR-196b可能是肝癌治療的途徑之一。以后將會探討miR-196b在肝癌細胞裸鼠移植瘤生長中的作用和機制。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：肖二輝負責課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；寧會彬、殷輝參與收集數(shù)據(jù)；康月花、趙巖負責實驗操作；毛重山負責修改論文；馬力負責擬定寫作思路；尚佳指導撰寫文章并最后定稿。