楊自力， 張任飛， 何 欣， 張 潔， 萬 祎

綿陽市第三人民醫(yī)院(四川省精神衛(wèi)生中心) a. 檢驗科； b. 肝膽外科， 四川 綿陽 621000

HCV慢性感染可發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌(HCC)[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織[2]估計，2015年全球有7100萬人慢性HCV感染，約40萬人死于HCV感染引起的肝硬化或HCC。HCV 1b基因型是發(fā)生HCV相關HCC(HCV-HCC)的高危因素[3]。P53抗體是較為明確與HCC發(fā)生有關的腫瘤相關抗原自身抗體[4]。HCC的早期診斷可以顯著提高患者的生存率，但早期診斷目前仍然是HCC診治技術的重點和難點。我國《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[5]明確指出：甲胎蛋白異質(zhì)體(alpha-fetoprotein-L3, AFP-L3)可作為肝癌早期診斷標志物，特別是對于AFP陰性人群。近年來，血清AFP-L3聯(lián)合其他指標早期診斷HCC已成為研究熱點[6-7]，但HCV-HCC早期診斷的相關研究并不多見。本研究結合HCV基因型、AFP-L3(%)及P53抗體，探討三者聯(lián)合檢測對HCV-HCC的早期診斷價值。

1 資料與方法

本研究嚴格按照國際《TRIPOD聲明》[8]報告清單格式撰寫。

1.1 研究對象 選取2016年1月-2019年12月在綿陽市第三人民醫(yī)院就診的丙型肝炎患者、HCV肝硬化患者及HCV-HCC患者。根據(jù)是否伴有HCC分為HCV-良性肝病組和HCV-HCC組。納入標準：HCV-良性肝病組符合《丙型肝炎診斷WS213-2018》[9]的標準，依據(jù)HCV RNA陽性結果做出確診。對于抗-HCV陰性、HCV RNA陽性患者，均結合臨床，必要時重新采血復查。對于確診丙型肝炎患者，根據(jù)流行病學史、臨床表現(xiàn)、肝組織病理學檢查、影像學及其他輔助檢查的相關肝炎及肝硬化典型表現(xiàn)診斷。HCV-HCC組中HCC診斷標準符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》[10]：結合臨床結節(jié)大小、影像學檢查(MRI/CT/CEUS/EOB-MRI)與穿刺活檢的相關肝癌典型表現(xiàn)診斷HCC。HCC中確診合并HCV感染的列為研究對象。排除標準:合并其他病毒性肝炎、HBV/HCV混合感染、自身免疫性疾病及拒絕參加臨床試驗的人群均不列為研究對象。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 以真空不抗凝采血管采集所有受試者晨起的空腹靜脈血兩管，每管3～5 ml，室溫靜置15～30 min，離心機3000 r/min離心10 min，留取血清轉(zhuǎn)移至另一清潔的EP管內(nèi)，置于-70 ℃冰箱保存待用，統(tǒng)一檢測。

1.2.2 HCV基因分型檢測 采用PCR-反向點雜交技術進行HCV基因分型，儀器為Prism7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、電恒溫震蕩水槽，試劑由中山大學達安基因股份有限公司提供。

1.2.3 血清AFP-L3(%)測定 AFP-L3分離采用微量離心柱法,AFP采用電化學發(fā)光法,使用德國羅氏診斷公司 Cobase601分析儀及配套試劑；AFP-L3采用北京熱景生物技術有限公司AFP-L3親和吸附離心管分離。計算AFP-L3占總AFP 的比例，以AFP-L3≥10%作為陽性標準。

1.2.4 血清P53抗體測定 采用ELISA方法，試劑使用海聯(lián)生物生產(chǎn)的抗P53(IgG)ELISA檢測試劑盒，嚴格按說明書操作。以0.25～8.0 ng/ml作為參考范圍。

1.3 樣本量估算 采用AFP-L3(%)與P53抗體為主要評價指標，以樣本量計算軟件PASS 15的診斷試驗[基于兩個受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積(AUC)]進行樣本量初步評估[11]。根據(jù)預實驗結果：AFP-L3(%)與P53抗體的AUC大致為0.75與0.85。取α=0.05、β=0.2，估算最小樣本量為陽性組79個樣品和陰性組79個樣品。估計失訪率為5%。

1.4 倫理學審查 本研究經(jīng)綿陽市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準[編號2018審(003)]，所有研究對象均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 最終納入HCV-良性疾病組、HCV-HCC組患者均84例。HCV-良性肝病組與HCV-HCC組性別構成比相似(P=0.079)。HCV-HCC組的平均年齡高于HCV-良性肝病組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；HCV-良性肝病組ALT、AST水平均高于HCV-HCC組，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.001)；HCV-良性肝病組與HCV-HCC組的HCV基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(P=0.037)(表1)。

表1 兩組患者一般資料

2.2 兩組患者AFP-L3(%)、P53抗體、HCV 1b基因型(%)差異 血清AFP-L3(%)水平在HCV-良性肝病組和HCV-HCC組分別為17.50(11.00～23.00)和88.00(35.25～122.00)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-9.27，P<0.001)。血清P53抗體水平在HCV-良性肝病組和HCV-HCC組分別為6.90(3.80～11.40) ng/ml和55.00(23.00～77.00)ng/ml，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-9.92，P<0.001)。血清HCV 1b基因型在HCV-良性肝病組和HCV-HCC組分別為45例(54%)、60例(71%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 5.714，P=0.017)。

2.3 AFP-L3、P53抗體與HCV基因分型多因素logistic回歸分析 單因素分析結果顯示，HCV基因分型、AFP-L3(%)與P53抗體與HCV-HCC相關(P值均<0.05)，可納入多因素回歸模型。采用多項logistic前進回歸分析：剔除引起明顯多重共線性的指標，進入的P值設為0.05，排除的P值設為0.10。結果顯示，AFP-L3(%)、P53抗體、HCV基因分型對HCV-HCC的影響均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表2)。通過logistic前進法將HCV基因分型、AFP-L3(%)與P53抗體重新擬合并建立模型：Logit(Y)=-3.881+0.031XAFP-L3(%)+0.043XP53+1.218XHCV基因分型。Y為聯(lián)檢的陽性概率值。

表2 AFP-L3(%)、P53抗體、HCV基因型的多因素logistic回歸分析

2.4 ROC曲線分析和診斷價值 將Y和單項指標AFP-L3(%)、P53抗體、HCV基因型進行ROC曲線分析，取Youden指數(shù)最大時對應值為Cut-off值，比較敏感度和特異度等參數(shù)。結果顯示AFP-L3(%)、P53抗體和Y的Cut-off值分別為22%、18 ng/ml和0.248。AUC比較結果顯示，P53抗體篩查HCV-HCC 的AUC為0.887，明顯高于HCV基因型的0.758(Z=3.12,P=0.002)和 AFP-L3(%)的0.863(Z=0.78,P=0.44)；Y篩查HCV-HCC的AUC為0.945，明顯高于HCV基因型的0.758(Z=6.17,P<0.001)和 AFP-L3(%)的0.863(Z=3.97,P<0.001)及P53抗體的0.887(Z=3.07,P=0.002)。單項指標之間比較結果顯示，AFP-L3(%)的特異度、陽性預測值均高于P53抗體、HCV基因型；P53抗體的敏感度、陰性預測值、AUC、診斷符合率均高于AFP-L3(%)、HCV基因型。Y與單項指標比較結果顯示，Y的AUC、敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及診斷符合率均高于單項中較高的檢測指標，分別為0.945、90.90%、94.00%、93.80%、91.16%及92.44%(圖1，表3)

3 討論

HCC是目前我國第4位常見惡性腫瘤及第2位致死性腫瘤[12]，早期診斷HCC具有重要意義。AFP-L3和P53抗體在早期診斷HCC中具有一定價值[13]。但是在臨床實際中，單項指標檢測篩查HCC效果不理想，而聯(lián)合檢測或許是更有前景的方案。本研究采用HCV基因型、AFP-L3(%)及P53抗體聯(lián)合檢測篩查HCC，結果顯示，AFP-L3(%)、P53抗體有助于HCV-HCC與良性肝病組的鑒別診斷。通過logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，HCV基因分型對HCV-HCC的影響有統(tǒng)計學意義，HCV 1b基因型患HCV-HCC的風險為非1b基因型的2.381倍，這與Lee等[14]的研究結果一致。此外，研究發(fā)現(xiàn)AFP-L3、P53抗體和HCV基因型對HCV-HCC的影響均有統(tǒng)計學意義，HCV基因型的 OR值(3.381)最大，AFP-L3的 OR值(1.032)最小，即同等條件下，檢測指標每增加一個單位患HCC的風險：HCV基因型(提升2.381倍)>P53抗體(提升0.344倍)>AFP-L3(提升0.032倍)，表明肝細胞癌變與HCV基因型及P53抗體密切相關，這與Busato等[15]的研究結論基本一致。本研究ROC曲線分析結果顯示，P53抗體的敏感度高于AFP-L3(%)，與Hwang等[16]的研究結論一致。但P53抗體在自身免疫疾病和一些健康人群中也會被檢出，存在特異度較低的缺點。在本研究中，AFP-L3(%)的特異度高于P53抗體，但敏感度較低，與Ma等[17]的研究結論一致。此外，AFP-L3(%)、P53抗體的Cut-off值分別為22%、18 ng/ml，與試劑盒推薦的陽性臨界值有差異，與謝芳等[6]的報道類似，是否HCV-HCC的臨界值與HCC的臨界值不同，這一問題尚需進一步研究探討。

表3 AFP-L3(%)、P53抗體、HCV基因型與Y的診斷價值比較

為提升早期診斷HCV-HCC臨床應用價值，筆者考慮將P53抗體、AFP-L3與HCV 1b 基因型聯(lián)合檢測HCC。通過多因素logistic建立模型獲得3項聯(lián)檢的陽性概率值(Y)，結果顯示，Y的AUC、敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及診斷符合率均高于單項指標中較高的檢測指標，證實了聯(lián)合檢測優(yōu)于單項指標檢測。此外，已有研究[18]表明，在HCC早期，血清學檢測腫瘤相關標志物可在影像學確診前0.5～1.5年升高。因此，在當臨床上發(fā)現(xiàn)有HCV基因型1b型及AFP-L3(%)與P53抗體升高而影像學未見異常的患者，應定期隨訪復查，以達到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療HCV-HCC的目的。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻聲明：楊自力負責課題設計及實施，資料分析，撰寫論文，質(zhì)量控制；張任飛負責擬定寫作思路，課題分工，修改論文；何欣、張潔負責資料收集整理，標本檢測，數(shù)據(jù)錄入，試劑的管理；萬祎負責臨床病例數(shù)據(jù)的收集。