趙燕，張婷，史繼敏，李剛

1 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海201508；2 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院臨床研究中心，上海201508

肺炎克雷伯菌是一類革蘭陰性桿菌，動(dòng)力陰性，能發(fā)酵乳糖，廣泛存在于各種環(huán)境中，是醫(yī)院獲得性感染常見病原菌之一[1]。肺炎克雷伯菌分為高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella Pneumoniae，hvKP）和經(jīng)典肺炎克雷伯菌（classic Klebsiella Pneumonia，cKP）。hvKP 可引起社區(qū)獲得性肝膿腫，且常常繼發(fā)遠(yuǎn)距離播散引起腦膿腫、肺部感染、眼部感染等，死亡率高。hvKP 最重要的毒力因子是莢膜多糖，與hvKP 關(guān)聯(lián)的莢膜多糖血清型有K1、K2、K5、K54、K57 等[2-5]。cKP 常引起醫(yī)院獲得性感染，其對(duì)碳青霉烯耐藥率逐年升高，攜帶blaKPC 是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯最常見的原因[6]。明確攜帶的耐藥基因?qū)εR床治療藥物的選擇有重要的指導(dǎo)作用。近年來(lái)hvKP和cKP 有逐步融合進(jìn)化的趨勢(shì)，一方面hvKP 通過(guò)水平轉(zhuǎn)移的機(jī)制獲得耐藥基因，呈現(xiàn)出高耐藥高毒力的特征[7-8]；另一方面cKP 獲得毒性質(zhì)粒呈現(xiàn)出高耐藥高毒力的特征[9]。這些細(xì)菌都呈現(xiàn)出高毒力高耐藥的特征，感染后患者治療選擇有限，預(yù)后差。因而本研究收集上海某三級(jí)綜合醫(yī)院2018年10月—2018年12月老年患者非重復(fù)分離的肺炎克雷伯菌58 株，利用多重PCR 法檢測(cè)老年患者感染肺炎克雷伯菌的血清型、毒性質(zhì)粒攜帶的rmpA2 基因及blaKPC 耐藥基因，為臨床治療、感染控制提供支持。

1 材料方法

1.1 菌株6 株陽(yáng)性對(duì)照菌株為本實(shí)驗(yàn)室前期已完成基因組測(cè)序肺炎克雷伯菌，分別為ST23 克隆K1 血清型、ST1049 克隆K5 血清型、ST29 克隆K54 血清型、ST592 克隆K57 血清型、ST65 克隆K2 血清型攜帶blaKPC 耐藥基因、ST11 克隆K64 血清型攜帶blaKPC耐藥基因及pLVPK 樣毒性質(zhì)粒，臨床菌株為2018年10月—2018年12月老年患者非重復(fù)分離的肺炎克雷伯菌58 株。

1.2 試劑及儀器多重 PCR 試劑盒（Thermo fisher 公司）,DNA 抽提試劑（生工生物工程上海股份有限公司），PCR 擴(kuò)增試劑、擴(kuò)增儀（寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京) 有限公司）、電泳儀器及成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）、引物由蘇州金維智生物有限公司合成（見表1）。抗菌藥物包括阿米卡星、慶大霉素、氨芐西林、哌拉西林、頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、亞胺培南、甲氧芐啶/磺胺甲嗯唑、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、美羅培南、哌拉西林一他唑巴坦、舒巴坦、替加環(huán)素、多黏菌素B 購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司。

1.3 細(xì)菌鑒定及藥物敏感試驗(yàn) 所有細(xì)菌均采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定，KB 法檢測(cè)藥物敏感性試驗(yàn)，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.4 藥物拉絲試驗(yàn) 臨床分離肺炎克雷伯菌種接種到哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，置于37°C 培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。次日用接種環(huán)挑起一個(gè)菌落并輕輕向上拉起，如果拉出的粘液絲長(zhǎng)度超過(guò)5 mm 時(shí)，判斷為拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為拉絲試驗(yàn)陰性。

1.5 基因組DNA 提取 將-80℃凍存的肺炎克雷伯菌臨床分離株轉(zhuǎn)種于血平板上，置于孵箱37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床200 轉(zhuǎn)/min 過(guò)夜培養(yǎng)，取1 mL 菌液用磁珠法細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 多重PCR及電泳根據(jù)生物信息學(xué)及文獻(xiàn)分析的基礎(chǔ)上，針對(duì)臨床分離率較高的前5 種血清型、rmpA2基因、及blaKPC 耐藥基因設(shè)計(jì)引物，建立多重PCR同時(shí)檢測(cè)老年患者感染肺炎克雷伯菌的血清型、毒性質(zhì)粒攜帶的rmpA2 基因及BlaKPC 耐藥基因。先將引物稀釋至100mol/L 待用，再稀釋至每條引物終濃度稀釋至0.1mol/L，PCR 擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 秒，60℃退火90 秒，72℃延伸40 秒，30 個(gè)循環(huán)后再延伸5min。產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，Gelred 熒光染料染色，凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果 以2017 版CLSI 為判斷標(biāo)準(zhǔn)，58 株肺炎克雷伯菌中對(duì)頭孢噻肟或頭孢他啶耐藥20株，占比34.5%；亞胺培南和美羅培南耐藥15 株，占比25.9%。未檢出替加環(huán)素及多黏菌素耐藥菌株，所有碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌均攜帶blaKPC 基因。

2.2 拉絲試驗(yàn)結(jié)果58 株肺炎克雷伯菌中拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性共25 株，占43.1%，拉絲試驗(yàn)陰性33 株，占56.9%。

2.3 多重PCR結(jié)果以本實(shí)驗(yàn)室前期已完成基因組測(cè)序的ST23 克隆K1 血清型、ST1049 克隆K5 血清型、ST29 克隆K54 血清型、ST592 克隆K57 血清型、ST65克隆K2 血清型攜帶BlaKPC 耐藥基因、ST11 克隆K64 血清型攜帶BlaKPC 耐藥基因及pLVPK 樣毒性質(zhì)粒為參考菌株來(lái)優(yōu)化多重PCR 體系。結(jié)果見圖1，所有目標(biāo)基因擴(kuò)增條帶均清晰可見。58 株臨床菌株中，以攜帶rmpA2 為判斷標(biāo)準(zhǔn)共檢出24 株hvKP（41.4%），其中K1 血清型hvKP7 株（12.1%）、K2 血清型hvKP4 株（6.9%）、K5 血清型hvKP2 株（3.4%）、K54 血清型hvKP2 株（3.4%），單獨(dú)攜帶rmpA2 基因血清型未知hvKP2 株（3.4%），同時(shí)攜帶rmpA2 及BlaKPC 基因肺炎克雷伯菌7 株（12.1%）。見圖2及表2。

3 討論

本研究中58 株肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南和美羅培南耐藥的耐藥率為25.9%，而同期CHINET 監(jiān)測(cè)網(wǎng)亞胺培南耐藥率為26.1%（http: //chinets.com/），與本研究基本一致。肺炎克雷伯菌耐藥物機(jī)制主要有產(chǎn)生各種水解酶、外膜蛋白缺失致滲透性降低、外排泵高表達(dá)、靶位點(diǎn)改變等[10]。本研究中15 株碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌均攜帶blaKPC 耐藥基因，說(shuō)明攜帶blaKPC 耐藥基因是本研究所收集碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌的主要耐藥機(jī)制。blaKPC 耐藥基因通常位于質(zhì)粒上，通過(guò)質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移在不同細(xì)菌種屬間廣泛播散，尤其是在炎克雷伯菌中blaKPC 檢出率最高，給臨床治療帶來(lái)極大困難[11]。

58 株肺炎克雷伯菌中拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性共26 株，占44.8%，高粘液表型是hvKP 顯著特征，因而拉絲試驗(yàn)被發(fā)展用來(lái)檢測(cè)hvKP，然而近年來(lái)研究報(bào)道部分低毒力ST11 型肺炎克雷伯菌呈現(xiàn)高粘液表型，有學(xué)者提出高粘液和高毒力是兩種不同的表型[12-13]，限制了拉絲試驗(yàn)在臨床的廣泛使用。在25 株拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性肺炎克雷伯菌中15 株為常見的高毒力血清型，另外9 株rmpA2 陽(yáng)性血清型未知的菌株。rmpA2 編碼莢膜多糖調(diào)節(jié)因子，位于pLVPK樣毒性質(zhì)粒上，pLVPK樣毒性質(zhì)粒通常在170kb 至220kb 大小，是hvKP 的標(biāo)志之一，幾乎存在于所有的hvKP 中，目前只有臺(tái)灣曾報(bào)道肺炎克雷伯菌1084 不含有此類質(zhì)粒[14]。香港Yang 等報(bào)道毒性質(zhì)粒可通過(guò)接合方式自主轉(zhuǎn)移，從而增加經(jīng)典肺炎克雷伯菌莢膜多糖的產(chǎn)量，提高肺炎克雷伯菌在小鼠及大蠟螟模型上的致病性[15]。浙江大學(xué)Gu D 等報(bào)道碳青霉烯耐藥的cKP 中發(fā)現(xiàn)了pLVPK 樣毒性質(zhì)粒，呈現(xiàn)出粘液樣表型，5 例年齡53～73 感染的病人全部死亡[9]。本研究中攜帶rmpA2 血清型未知的高毒力肺炎克雷伯菌9 株，其中攜帶blaKPC 耐藥基因的高毒力碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌7株，碳青霉烯耐藥的hvKP 已在住院老年患者中流行。

綜上所述，本研究中老年患者分離的肺炎克雷伯菌中碳?xì)涿瓜┧幬锬退幝视休^高的檢出率，攜帶bla-KPC 耐藥基因是耐藥的主要原因；高毒力肺炎克雷伯菌的比例高達(dá)41.4%。老年患者身體機(jī)能退化、免疫功能降低，且易患糖尿病、高血壓、腎功能損傷等各種基礎(chǔ)疾病，因此老年住院患者更易發(fā)生醫(yī)院獲得性感染。老年患者感染后發(fā)病不典型，早期診斷難度大，容易并發(fā)多器官損傷甚至功能衰竭，治療預(yù)后差。因而醫(yī)院應(yīng)加強(qiáng)對(duì)老年患者感染高毒力肺炎克雷類伯菌及碳?xì)涿瓜┠退幏窝卓死最惒谋O(jiān)測(cè)，減少感染發(fā)生。