楊禮，宮藝其，吳蕾，張侃，付煒，王偉，鄭吉建，朱明

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海200032；2.上海交通大學附屬上海兒童醫(yī)學中心心胸外科，上海200127；3.上海交通大學附屬上海兒童醫(yī)學中心麻醉科，上海200127

隨著人口老齡化的日益加速，心肌梗死和心力衰竭等心臟疾病的發(fā)生率逐年上升。既往研究表明，人誘導多能干細胞來源心肌細胞（human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes,hiPSC-CM）移植在治療心肌梗死、心力衰竭等心臟疾病顯示出良好的應用前景[1,2]。然而，不同于正常的心房和心室肌，絕大多數(shù)hiPSC-CM 具有自發(fā)性節(jié)律[3,4]。將具有自發(fā)節(jié)律性的hiPSC-CM 移植到跳動的心臟后不僅可能影響正常的心臟跳動，而且存在不同的藥物反應性[5]。故研究hiPSC-CM 的自發(fā)節(jié)律性調(diào)控機制，能讓其更好的用于臨床。而HiPSC-CM 的自發(fā)節(jié)律性與細胞膜上的各種離子通道活動密切相關。起搏電流在起搏細胞的自發(fā)節(jié)律性中起著關鍵作用，而hiPSC-CM上亦存在有超極化激活的起搏電流。氯化銫為經(jīng)典的起搏電流阻斷劑，可通過阻斷鉀電流而抑制起搏電流。氯化銫是否通過影響起搏電流導致hiPSC-CM 的自發(fā)性節(jié)律的改變，目前仍不清楚。本研究采用轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的hiPSC-CM 和膜片鉗技術探討氯化銫對hiPSC-CM自發(fā)動作電位和起搏電流的影響。

1 材料與方法

1.1 人誘導多能干細胞分化為心肌細胞 人誘導多能干細胞由上海兒童醫(yī)學中心李彥欣教授課題組提供。首先鑒定人誘導多能干細胞的干性，方法為：預先鋪好基質(zhì)膠（美國Corning 公司354234）后，將1×105個/孔細胞接種于24 孔板玻璃爬片上。直至細胞融合至40%～50%時，使用4%的多聚甲醛在室溫下固定細胞20 min，然后使用0.5%TritonX-100 室溫破膜30 min，再用10%山羊血清室溫下封閉30 min，最后添加tra-1-60 抗體（德國Merck Millipore 公司MAB4360），sox2 抗體（美國Epitomics 公司2683-1），nanog 抗體（美國Epitomics 公司3369-1），oct4 抗體（美國Epitomics 公司2876-1）（1: 200）4℃孵育過夜。PBS 清洗三遍后添加相應熒光二抗（1: 1000），室溫下避光孵育120 min。dapi（1: 1000）室溫核染10min 后使用激光共聚焦顯微鏡觀察。

心肌分化方法為：人誘導多能干細胞由Accutase消化酶（7920,STEMCELL Technologies,Canada）消化成單個細胞后按1×106個/孔接種于提前鋪好基質(zhì)膠的12 孔板。直至細胞完全融合后再加入含12M CHIR99021（加拿大Stemcell公司72054）的RPMI1640（美國Thermo 公司11875093）/B27 minus insulin（美國Thermo 公司A1895601）分化培養(yǎng)基（加拿大Stemcell 公司05990）。培養(yǎng)24 h 后再更換為普通的RPMI1640/B27 minus insulin 培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后再加入5M IWP-2（加拿大Stemcell 公司72124）的RPMI1640/B27 minus insulin 分化培養(yǎng)基。再過48 h后更換為普通RPMI1640/B27 minus insulin 培養(yǎng)基。再過48h 更換RPMI1640/B27 培養(yǎng)基，后每更換1 次RPMI1640/B27 培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，直至第60 天。

1.2 hiPSC-CM的分子生物學鑒定 預先鋪好基質(zhì)膠后，將1×105個/孔細胞接種于24 孔板玻璃爬片上。用4%的多聚甲醛在室溫下固定細胞20 min，再用0.5%TritonX-100 室溫下破膜30 min，10%山羊血清室溫下封閉30 min，再添加cTnT 抗體（美國Proteintech 公司15513-1-AP）4℃孵育過夜。最后用PBS 清洗3 遍，添加相應熒光二抗（1:1 000）室溫避光孵育120 min。dapi（1: 1000）室溫核染10 min 后使用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3 單個hiPSC-CM 的制備 將35 mm 孔徑培養(yǎng)皿中培養(yǎng)60d hiPSC-CM（由上海市兒童醫(yī)學中心王偉教授提供）用Accutase 消化酶1mL 消化20 min～40 min（37℃），使用倒置顯微鏡動態(tài)觀察細胞消化情況，直到扁平鋪開的細胞出現(xiàn)裂解，再用記錄動作電位的細胞外液從培養(yǎng)皿的一側(cè)持續(xù)灌流，培養(yǎng)皿的另外一側(cè)使用負壓泵持續(xù)吸引，調(diào)節(jié)灌流速度和負壓吸引速度，維持培養(yǎng)皿內(nèi)的液體處于相對穩(wěn)定的液面高度。灌流后在顯微鏡下可見培養(yǎng)皿內(nèi)的細胞恢復跳動，收縮變圓成單個細胞（圖1）。室溫（20～24℃）下保存，時間不超過6h。

1.4 電生理學方法 在倒置顯微鏡（ECLIPSE Ti-U,Nikon,Japan）下選擇單個飽滿貼壁并且折光度好的細胞進行試驗。使用微電極拉制儀（美國SUTTER 公司P-97 微電極拉制儀）將微玻璃電極拉制好以后充滿電極內(nèi)液，并測試電極電阻，可選擇阻抗在2 ～4 M的電極用于試驗?？捎? mL 注射器在玻璃電極入水前給予0.5 mL 的正壓，防止電極入水后電極尖端被空氣浴液界面上積聚的灰塵或溶液中的離子污染，進而妨礙緊密封接的形成。通過微操縱儀將玻璃微電極緩慢推向細胞表面附近直至緊貼細胞，動態(tài)監(jiān)測電極電阻的變化，當封接阻抗大于1 G時，穩(wěn)定1 min 后用5mL 的注射器負壓吸破細胞膜，快速補償電容電流和串聯(lián)阻抗（補償40%～80%）形成全細胞記錄狀態(tài)。

采用電流鉗記錄自發(fā)動作電位（膜片鉗電信號放大器：美國Axon 公司700B；膜片鉗數(shù)模轉(zhuǎn)換器：Digidata 1550A,Axon Instruments,Inc.,Union City,CA,USA），使用gap-free 模式記錄，動作電位記錄信號的采樣頻率為1 kHz，低通Bessel濾波頻率為0.5 kHz；采用電壓鉗記錄起搏電流，起搏電流信號的低通Bessel濾波頻率為2 kHz，采樣頻率為10 kHz。起搏電流的刺激程序為：鉗制膜電位于-50 mV，階躍電壓設置為-10 mV，超極化至-150 mV，超極化持續(xù)時間為3 s，在各指令電壓結(jié)束后再除極化到20 mV 測試尾電流，除極化持續(xù)時間為0.5 s。采用“Y-tube”系統(tǒng)灌流給藥，灌流速度為3 mL/min。每次灌流液體10 mL（約為培養(yǎng)皿內(nèi)液體的5 倍）可基本置換培養(yǎng)皿內(nèi)的液體。既往研究表明，濃度為2 mM 的氯化銫可明顯抑制起搏電流[4]，故本實驗前用細胞外液將氯化銫（Sigma 公司）配置濃度為2 mM。

液體配方如下：動作電位所用細胞外液（mM）：NaCl 140,KCl 5,CaCl21,MgCl21,Glucose 10,HEPES 10（pH 7.4,NaOH）；動作電位電極內(nèi)液（mM）：KCl 150,NaCl 5,CaCl22,EGTA 5,HEPES 10,MgATP 5（pH 7.2,KOH）；起搏電流細胞外液（mM）：NaCl 137.7,KCl 5.4,MgCl21,CaCl21.8,HEPES 5,NaOH 2.3,glucose 10,4-aminopyridine 2,BaCl25,CdCl20.2（pH 7.4,NaOH）；起搏電流電極內(nèi)液（mM）：NaCl 6,K-aspartate 130,MgCl22,CaCl22,EGTA 5,Na2ATP 2,NaGTP 0.1,cAMP 0.2,HEPES 5（pH 7.2,KOH）。

1.5 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)資料采用Clampfit 10.5 和Origin 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。Clampfit 軟件主要用于圖像的采集、數(shù)據(jù)的測量；Origin 8.0 主要用于各種線圖的制作及各種示意圖的編輯。結(jié)果以均數(shù)±標準差（±SD）表示。樣本量（number，n）表示所記錄心肌細胞的數(shù)量，每組數(shù)據(jù)記錄5 個心肌細胞。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析使用配對或不配對的 檢驗分析兩組之間的均數(shù)差異；采用方差分析比較多組之間的差異。＜0.05 認為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 人誘導多能干細胞的干性鑒定及轉(zhuǎn)化心肌細胞的分子生物學鑒定 前期研究表明，人誘導多能干細胞免疫熒光染色顯示細胞核內(nèi)多能性標志物oct4，sox2，nanog 及細胞表面多能性標志物tra-1-60 為強陽性表達。免疫熒光染色顯示hiPSC-CM 上表達心肌細胞特異性標志物cTnT[6,7]。

2.2 hiPSC-CM 自發(fā)動作電位的特性 顯微鏡下觀察，hiPSC-CM 消化前呈條索狀，扁平貼于培養(yǎng)皿，可見自發(fā)跳動（圖1a）；消化后呈圓形或橢圓形，顯微鏡下折光度增強（圖1b）。所記錄hiPSC-CM 動作電位具有自發(fā)節(jié)律性（圖1c），動作電位具有明顯的平臺期（圖1d）。

2.3 氯化銫對hiPSC-CM 動作電位頻率、靜息電位、振幅、90%復極時間的影響 2 mM 氯化銫增加hiPSCCM 自發(fā)動作電位的頻率（=0.003,= 5，圖2b），提高動作電位的靜息電位（＜0.001,=5，圖2c），降低動作電位的振幅（=0.002,=5，圖2d），縮短動作電位APD90（＜0.001,=5，圖2e）。

2.4 氯化銫對hiPSC-CM起搏電流的影響 所記錄hiPSC-CM 均有起搏電流，起搏電流為超極化激活的內(nèi)向電流，具有平臺期電流和尾電流（圖3a）。2 mM 氯化銫明顯抑制起搏電流的平臺期電流（＜0.05,=5）（圖3b）以及尾電流（＜0.05,=5）（圖3c）。

3 討論

氯化銫因可通過阻斷鉀電流而抑制起搏電流，而成為經(jīng)典的阻斷起搏電流的工具藥。因其與鉀具有相似的生物學特性，臨床上可作為甲狀腺癌的陽性顯像劑，亦可作為心肌灌注顯像劑；還有學者提出氯化銫可通過提高機體的pH 值而用于惡性腫瘤的治療，即氯化銫的高pH 值療法。氯化銫在臨床應用時，有報道稱可引起心律失常，嚴重的還可引起危及生命的心臟疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，氯化銫增快hiPSC-CM 自發(fā)動作電位的頻率，提高hiPSC-CM 動作電位的靜息電位，降低動作電位的振幅以及縮短APD90，并明顯抑制起搏電流的平臺期電流以及尾電流。本研究在探討氯化銫臨床應用時引起心臟不良反應具有參考價值，氯化銫可改變心室肌細胞的節(jié)律性，有引發(fā)室性心律失常的風險。

所記錄hiPSC-CM 自發(fā)動作電位均具有明顯平臺期，提示所記錄均為心室肌樣細胞，且均具有自律性。氯化銫可增強該自律性，即氯化銫增快hiPSC-CM 自發(fā)動作電位的頻率。竇房結(jié)相關研究表明，正常竇房結(jié)起搏細胞的超極化激活電流幅度對起搏細胞自發(fā)節(jié)律的快慢起著重要作用，超極化電流持續(xù)時間決定了自發(fā)性節(jié)律的間隔時間[8]，如超級化電流受到抑制，則會引起自發(fā)性節(jié)律降低。而超極化電流主要由起搏電流構(gòu)成。故抑制起搏電流可使竇房結(jié)起搏細胞的自律性降低。而本研究中氯化銫明顯抑制hiPSC-CM 的起搏電流，卻使hiPSC-CM 自發(fā)動作電位的頻率增快。這與既往的研究結(jié)果氯化銫抑制竇房結(jié)細胞的自律性不同。起搏細胞的自律性除受膜時鐘（起搏電流等）控制，還受細胞內(nèi)鈣時鐘的調(diào)節(jié)[9]。細胞內(nèi)周期性的鈣釋放在細胞的自律性中起著關鍵性作用。具體在膜時鐘和鈣時鐘之間，哪個占據(jù)主導地位仍有待進一步研究。氯化銫是否通過影響細胞內(nèi)鈣時鐘節(jié)律來增加自發(fā)動作電位的節(jié)律仍不清楚，還有待進一步研究。另外，hiPSC-CM 心室肌樣細胞具有自律性仍是其不成熟的標志之一，如何消除其自律性目前仍不清楚。hiPSC-CM 是否具有與人體正常起搏細胞不同的起搏機制亦有待進一步研究。

另有研究表明[10]，氯化銫可引起QT 間期延長導致室性心律失常，其機制可能是通過抑制IK1 而致復極延長誘發(fā)早后除極。當早期后除極的除極幅值達到鄰近細胞的閾電位后，可以引起臨近細胞產(chǎn)生一個動作電位甚至一串動作電位，造成室性心律失常。本試驗的研究對象為單個細胞，不受鄰近細胞的影響，亦不受自主神經(jīng)的調(diào)控，氯化銫仍可引起hiPSC-CM 自發(fā)動作電位的頻率增加，表明其與氯化銫對單個hiPSC-CM 的直接作用有關。這說明了hiPSC-CM 與正常的心室肌細胞仍存在差異，Sayaka Yonemizu 等人的研究顯示在hiPSC-CM 上未能檢測到T 型鈣通道和緩慢激活延遲整流鉀通道電流[4]，Gracious R.Ross 等人的研究亦顯示不同的培養(yǎng)時間下hiPSC-CM 的Na+電流以及Ca2+電流特性存在差異[11]，而細胞的節(jié)律性與細胞上面的離子通道的活動密不可分，氯化銫具體通過影響何種離子通道改變hiPSC-CM 的節(jié)律性仍有待后續(xù)研究。通過對動作電位的進一步分析，可見氯化銫提高靜息電位，提高了細胞的興奮性。氯化銫還引起APD90 的縮短，APD90 縮短可導致自發(fā)性動作電位的間隔時間縮短，從而加快自發(fā)性動作電位的節(jié)律。一般認為，心肌細胞的鈣通道和/或鉀通道是APD90 的主要影響因素。因此，氯化銫對hiPSC-CM鈣和/或鉀通道電流的影響還需要進一步研究。另外，本研究仍有許多不足之處，如研究顯示hiPSC-CM 成熟度低，存在較大異質(zhì)性[5]，該研究宜收集更多樣本進行分析。

氯化銫增加hiPSC-CM 自發(fā)動作電位的自發(fā)節(jié)律性，并抑制其起搏電流。其提示hiPSC-CM 可能具有不同于正常心室肌細胞的電生理特性。本研究亦為hiPSC-CM 的臨床應用提供更為全面的基礎理論。