胡振，張瑾，賈偉

（合肥工業(yè)大學土木與水利工程學院，安徽合肥 230009）

近年來，人類不斷發(fā)現(xiàn)各種各樣的新能源[1]，隨著研究的不斷深入，這些新能源的優(yōu)缺點也逐漸被人們所了解。其中，微藻作為光合微生物，具有生產(chǎn)周期短、生長繁殖快、可吸收水體中的營養(yǎng)物質(zhì)進行新陳代謝并進行光合作用產(chǎn)出油脂等特點，在廢水的處理和生物燃料的制備中被廣泛研究應(yīng)用。在這些研究中，微藻的捕獲是制作生物燃料的的關(guān)鍵步驟，但由于其細胞的尺寸較小，且細胞因表面帶負電而互相排斥[2]，從而使微藻回收成本過高，成為目前研究中的難點。本研究以小球衣藻為實驗藻種，研究在不同營養(yǎng)條件和附著材料下，小球衣藻的附著行為，同時進行附著材料對營養(yǎng)物質(zhì)吸附量的測定和微藻胞外聚合物分泌量的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硝酸鈉，優(yōu)級純，國藥；氫氧化鈉、鹽酸、氨基磺酸、硫酸、蒽酮，均為分析純，國藥；Lorry低蛋白試劑，上海荔達。

Centrifuge5804高速離心機，德國Eppendorf；UV2600紫外分光光度計，上海Unico；BDP-250 CO2二氧化碳人工氣候箱，上海百典；KQ5200DE超聲波清洗器，江蘇昆山舒美；IX73+DP倒置顯微鏡，日本Olympus；LX-650-L高壓滅菌鍋，合肥華泰醫(yī)療。

1.2 實驗方法

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的小球衣藻懸液加入離心管中，在2 000 g條件下離心10 min，棄去上清液，進行重懸，并再次離心；重復2次去除藻液中含有的亞硒酸鹽富集培養(yǎng)基（SE培養(yǎng)基），即得到實驗用小球衣藻懸液，在無菌環(huán)境下密封備用。

配置5瓶硝態(tài)氮溶液，溶液中硝態(tài)氮濃度分別為SE培養(yǎng)基中硝態(tài)氮濃度的1、1/2、1/10、1/50、1/100，同時設(shè)置濃度為0的溶液作為對照。放入高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃條件下滅菌15 min后，加入試劑瓶中，每個濃度配置2瓶（A瓶、B瓶），將準備好的藻溶液加入各個試劑瓶中，并在試劑瓶中分別加入2 cm×2 cm的親水性碳紙（Ⅰ瓶）或疏水性碳紙（Ⅱ瓶），1 h和8 h后取樣分析藻類密度，每組實驗設(shè)置3組平行樣，每次實驗重復3次，實驗在二氧化碳人工氣候培養(yǎng)箱中進行，設(shè)置培養(yǎng)箱溫度為（25±1）℃，光照強度為2 000 lx，實驗中持續(xù)光照。

1.2.1 分光光度法測定藻類密度

小球衣藻在680 nm波長處的吸收峰較高，用紫外分光光度計在680 nm波長下測定其吸光度并從校準曲線中查得相應(yīng)的藻類密度，即為水樣測定結(jié)果（cells/mL）；水樣若經(jīng)稀釋后測定，則結(jié)果應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

1.2.2 運動速度的測定

取30 μL藻液放在載玻片上使用倒置顯微鏡進行顯微視頻拍攝，并將其連接到計算機，使用cellSens Standard軟件記錄運動視頻。每一組樣品拍攝一段視頻，使用Image J軟件進行細胞追蹤，將視頻用連續(xù)截屏功能按照500 ms/張的頻率進行截取，用Image J手動追蹤藻細胞并進行位置標識，以計算其運動速度。每個視頻中選取5個微藻的運動軌跡進行分析，每個微藻統(tǒng)計其20 s左右的平均運動速度。將小球衣藻在各個時間點的運動速度結(jié)果進行統(tǒng)計和歸納，并繪制出頻率分布圖和正態(tài)分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)條件對微藻附著的影響

分別在實驗進行到1 h和8 h時，對碳紙上小球衣藻的附著量和溶液中小球衣藻的懸浮量進行統(tǒng)計，結(jié)果如圖1所示。對溶液中的小球衣藻進行數(shù)量統(tǒng)計，如圖1A、1B所示，發(fā)現(xiàn)在各營養(yǎng)條件和附著材料下，溶液中懸浮的小球衣藻相差不大。從圖1C、1D可以看出，在1 h時，相同附著材料中，小球衣藻的附著量較接近；在8 h時，隨著溶液中硝態(tài)氮濃度的增加，小球衣藻的附著量出現(xiàn)先上升后降低的趨勢，并在營養(yǎng)限制性條件下（硝態(tài)氮濃度為1/10 SE）達到峰值，為（16.07±0.42）×104cells/cm2和（4.00±0.21）×104cells/cm2；且附著材料為親水性碳紙時小球衣藻的附著量明顯高于附著材料為疏水性碳紙時，最高附著量可達到其4倍左右。

圖1 不同營養(yǎng)濃度下小球衣藻的懸浮量和附著量

圖2 不同營養(yǎng)濃度影響下小球衣藻的運動速度

營養(yǎng)物質(zhì)濃度對小球衣藻的附著有一定影響，尤其在硝態(tài)氮濃度為1/10 SE時促進作用較明顯，且隨著時間增加影響逐漸加大；附著材料對微藻的附著也有著顯著影響。

2.2 不同營養(yǎng)物質(zhì)下小球衣藻的運動速度

研究表明，微藻的運動速度也是影響其附著的重要指標之一，所以研究營養(yǎng)物質(zhì)濃度對微藻運動速度的影響是很必要的。統(tǒng)計1 h和8 h時微藻的運動速度，并對其頻率進行正態(tài)分布的非線性擬合，擬合結(jié)果如圖2A、2C所示，將擬合后曲線中的速度期望進行整合，得到圖2B、2D的期望值。從圖中可以看出隨著營養(yǎng)物質(zhì)濃度的上升，小球衣藻的運動速度表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，并在1/10 SE培養(yǎng)基的硝態(tài)氮濃度下，運動速度出現(xiàn)峰值點，分別達到（26.60±0.69）μm/s、（25.21±0.89）μm/s，這種規(guī)律與微藻的附著結(jié)果類似，說明限制性營養(yǎng)濃度對小球衣藻的運動速度有促進作用；隨著運動速度的增加，微藻與碳紙的碰撞概率上升，進而促進了小球衣藻的附著

3 結(jié)論

營養(yǎng)物質(zhì)濃度和附著材料對小球衣藻的附著都有一定的影響，在硝態(tài)氮濃度為1/10 SE時，小球衣藻的附著達到峰值；限制性營養(yǎng)濃度對小球衣藻的運動速度有促進作用，進而促進小球衣藻的附著。