單蓉蓉，章鑫鑫，余超，魯新珠

（合肥工業(yè)大學土木與水利工程學院，安徽合肥 230009）

由于用戶用水量的動態(tài)變化，給水管網中水流流速也在不斷變化。水動力條件（流速、剪切力以及水力停留時間等）決定了營養(yǎng)物質、消毒劑和懸浮顆粒物的遷移和分布，同時也控制了微生物的一系列功能。研究表明，流態(tài)會影響營養(yǎng)物質及氧氣的傳輸[1]，從而影響細胞生長速率；流速越大剪切力就會越高，高剪切力可能導致生物膜脫落[2]。不僅如此，水動力改變也會影響胞外聚合物的分泌，高剪切力促進胞外多糖的分泌，進而調控微生物在其表面附著的同時起到保護屏障的作用。盡管如此，目前有關給水管網中流速對生物膜的形成還存在很多不清晰的地方。本實驗以自來水中的細菌為研究對象，通過構建動態(tài)模擬裝置試驗平臺，借助于活死細胞染色、Lowry蛋白法、硫酸蒽酮法等分析方法來觀測生物膜上的生物量及胞外聚合物，剖析流速對生物膜的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

LIVE/DEAD染 液[SYTO 9染 料0.33 mmol/L、碘化丙啶（PI）2 mmol/L]，賽默飛世爾科技；硫酸、蒽酮，分析純，國藥集團；Lorry低蛋白試劑，0.1～50 μg/mL，荔達公司；0.9%生理鹽水，國藥集團。

TH4-200熒光顯微鏡，日本奧林巴斯；MS-2000激光粒度分析儀，英國Malvern；UV2006紫外分光光度計，上海尤尼科。

1.2 實驗設置

研究流速對給水管網生物膜的影響，水樣取自市政給水管網，放置于3 000 mL錐形瓶中，四臺蠕動泵同時進行，采用外徑×內徑為6 mm×4.8 mm的PE管道，在封閉室溫條件下完成。實驗設置4個流速，分別是0.0 m/s、0.3 m/s、0.7 m/s和1.0 m/s。實驗前用最大流速以蒸餾水沖洗3次[3]，實驗進行過程中采用調整蠕動泵的轉速進行流速的控制。各實驗裝置取樣時間點為6 h、24 h、48 h、120 h及144h。實驗的取樣點選擇管網末端，在各時間點剪下2.0 cm管段。將剪下的管段放置于10 mL生理鹽水中震蕩懸浮用于管壁生物膜相關實驗參數的測試。

1.3 微生物的提取

將剪下來管段的外部用70%的酒精擦拭消毒，管段內部先用生理鹽水洗去管壁上懸浮的細菌，然后用消毒棉簽在管段內部擦拭5～10次，再將棉簽放入10 mL生理鹽水中，手搖30 s后在頻率為47 kHz超聲清洗儀超聲2 min[4]，將管壁生物膜融入生理鹽水中。管壁生物膜菌懸液用于細菌計數、胞外聚合物（多糖和蛋白）測定等。

1.4 細菌量的測定

細菌量的測定通過分子探針LIVE/DEAD細菌活性試劑盒來測定。具體操作過程為：取3 μL PI和3 μL SYTO 9加入5.0 mL樣品中，在室內避光染色30 min，將染色后的樣品通過直徑為25 mm、孔徑為0.22 μm的黑色聚碳酸酯膜，在熒光顯微鏡下進行觀察和拍照，在一定倍數下對同一樣品隨機拍攝10張照片，記錄細菌數。

1.5 胞外聚合物的提取及測定

采用加熱法對胞外聚合物進行提取。具體操作過程為：取15 mL樣品，加入生理鹽水，80 ℃水浴加熱60 min，蒸發(fā)至體積為15 mL，再通過0.22 μm濾膜過濾，濾液即為待測溶液。測定多糖（PS）濃度采用蒽酮法，用葡萄糖作標準曲線，在625 nm波長下用紫外分光光度計測定各個待測液的分光光度值[5]；測定蛋白（PN）濃度采用Folin-Lowry法，用牛蛋白血清作標準曲線，在750 nm波長下用紫外分光光度計測定各個待測液的分光光度值[5]。

1.6 Zeta電位的測定

測定水中懸浮細菌的Zeta電勢，利用MS-2000激光粒度分析儀進行測定，并利用分散技術軟件進行讀數。具體操作過程如下：搖勻細菌懸浮液，取750 μL樣品注入樣品池中，蓋上蓋子測定讀數。

2 結果與分析

2.1 流速對生物膜上生物量的影響

圖1為不同流速下生物膜上生物量的變化。在6 h時，流速從0 m/s增加至0.7 m/s，生物量從（8.4±2.1）×105cells/cm2增加到（14.5±3.3）×105cells/cm2；流速繼續(xù)增加至1.0 m/s，又導致生物量降低為（6.8±1.4）×105cells/cm2。隨著時間推移，生物量隨流速的變化是一致的，均是先增加后減小，在0.7 m/s達到峰值。在144 h時，0.7 m/s下的生物量達到（32.3±2.9）×105cells/cm2。適量的流速可以促進營養(yǎng)物質及氧氣傳輸加快生物膜生長，而剪切力過大又會導致生物膜脫落到水中。

圖1 不同流速下生物膜上生物量隨時間的變化

2.2 水流流速對管壁及溶液中微生物胞外聚合物分泌的影響

圖2顯示了胞外聚合物含量隨流速的變化。6 h時，多糖和蛋白含量從0 m/s的（0.5±0.1）μg/cm2、（0.9±0.2）μg/cm2增加至0.7 m/s的（0.9±0.1）μg/cm2、（1.1±0.2）μg/cm2，隨后在1.0 m/s又降低為（0.8±0.1）μg/cm2、（1.1±0.2）μg/cm2，在 0.7 m/s達到峰值。24 h到144 h，胞外聚合物增長模式一致，且分泌量越來越多。144 h后，0.7 m/s時多糖和蛋白增加到（2.2±0.5）μg/cm2、（1.3±0.2）μg/cm2。在水流剪切力脅迫下，細菌會分泌更多的胞外聚合物，形成保護膜來躲避惡劣環(huán)境的傷害；而剪切力過大又會導致細胞活性降低，胞外聚合物分泌量減少。

圖2 不同流速下生物膜上胞外聚合物分泌隨時間的變化

2.3 Zeta電位分析

圖3描述了主體水中Zeta電位的變化。據研究，Zeta電位絕對值越低，代表膠體穩(wěn)定性越低。從6 h至144 h，Zeta電位絕對值越來越大，膠體逐漸趨于穩(wěn)定。144 h后，流速從0 m/s增加至0.7 m/s，Zeta電位從（-15.1±0.8）mV減少至（-12.7±0.6）mV，流速繼續(xù)增大至1.0 m/s，電位又增加到（-14.1±2.2）mV。將Zeta電位與胞外聚合物的含量進行比較，發(fā)現(xiàn)Zeta電位與胞外聚合物和生物量成反比，說明膠體的不穩(wěn)定會促進細菌向載體表面附著。

圖3 不同流速下Zeta電位隨時間的變化

3 結論

適當大小流速可以促進生物膜上細菌生長和胞外聚合物分泌，高剪切力又會抑制生物膜生長。0.7 m/s主體水中，膠體最不穩(wěn)定，有利于細菌向載體表面附著。

目前對環(huán)境壓力下細菌增長機理方面的研究還不夠完善，仍有很多問題值得進一步去探索。結合本次所做的研究，還可以在以下方面進一步探索：

（1）本文的流速為恒定流速，而實際給水管網中的流速是波動的，波動流速對管網中細菌增長可能會有更大的影響，可以進一步去研究；

（2）本文對管網中生物膜的研究比較淺，只觀察到現(xiàn)象的變化，其中的機理并不清楚，可以通過建立模型或純種實驗進行更深入的研究剖析其中的機理。