詹剛，劉珍珍，田大勇

（上海青賽生物科技有限公司，上海 201500）

狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies Virus，RABV）引起的一種人獸共患病，一旦發(fā)病，致死率幾乎為100%[1]。目前，尚無有效治療狂犬病的藥物和方法，預(yù)防接種是控制狂犬病的唯一手段[2]。隨著我國社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的長足發(fā)展，政府對(duì)消滅狂犬病的重視程度與日俱增，民眾對(duì)狂犬病疫苗的有效性和安全性愈發(fā)重視。

純化工藝是狂犬病疫苗質(zhì)量的決定性因素之一。澄清工藝作為純化工藝前期對(duì)病毒收獲液預(yù)處理的必要手段，能夠有效將大粒徑的細(xì)胞碎片或細(xì)胞器等非病毒性顆粒物去除，從而顯著降低病毒收獲液的復(fù)雜程度，為疫苗的精細(xì)純化提供重要保障作用。

常用的病毒收獲液澄清策略有兩種，即膜過濾法和離心法。前者的工藝開發(fā)相對(duì)簡單，但在處理大量或者雜質(zhì)較多的樣品時(shí)，容易因?yàn)槟ぷ枞蚰て屏训炔淮_定性因素而影響澄清工藝的穩(wěn)定性；后者作為當(dāng)前病毒收獲液澄清工藝的主流方法，不僅能夠最大限度地減少病毒粒子所受剪切力從而有利于病毒粒子的結(jié)構(gòu)完整性，而且在工藝層面有較高的穩(wěn)定性和重復(fù)性。隨著連續(xù)流離心設(shè)備的普遍應(yīng)用，離心澄清工藝能夠處理的樣品量得到了極大的提升。

以原代雞胚成纖維細(xì)胞（Chicken Embryo Fibroblast，CEF）為生產(chǎn)基質(zhì)的狂犬病疫苗產(chǎn)品，具有安全性高、免疫原性好且產(chǎn)能充沛等特點(diǎn)。為了最大限度地減少對(duì)RABV病毒粒子結(jié)構(gòu)的破壞，本試驗(yàn)同時(shí)采用連續(xù)流高速離心澄清工藝和連續(xù)流蔗糖密度梯度超速離心純化工藝進(jìn)行研究，對(duì)不同離心力條件下大顆粒雜質(zhì)去除率和有效抗原回收率等方面開展系統(tǒng)研究，為凍干人用狂犬病疫苗（雞胚成纖維細(xì)胞）的連續(xù)流澄清工藝開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 毒株與細(xì)胞

RABV病毒滴定用乳倉鼠腎細(xì)胞BHK-21的克隆株BSR細(xì)胞為上海青賽生物科技有限公司建庫并保藏（代次：P45）；RABV Flurry HEP株工作種子為上海青賽生物科技有限公司制備并保藏，滴度7.0 lgCCID50/mL（CCID50為細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量），批號(hào)20171001。

1.2 試劑和耗材

0日齡SPF雞胚，批號(hào)20180918，購自浙江立華；細(xì)胞用培養(yǎng)基，批號(hào)PD201808008，上海青賽生物科技有限公司自主研發(fā)和配置；胎牛血清，批號(hào)201803015，購自蘭州榮曄；PBS，批號(hào)PD201808005，為上海青賽生物科技有限公司自配。TBST，批號(hào)PD20190319，為上海青賽生物科技有限公司自配；15 mL/30 kD超濾離心管，購自MILLIPORE；預(yù)制聚丙烯酰胺凝膠，批號(hào)1808170，購自Thermo Fisher；電泳緩沖液，批號(hào)1981884，購自 Thermo Fisher；蛋白 Marker，批號(hào) 161-0374，購自BIO-RAD；牛血清白蛋白（BSA），批號(hào)EZ241A400，購自BIOFROXX；HRP標(biāo)記的RABV G蛋白單克隆抗體，批號(hào)RVG20181125，上海青賽生物科技有限公司自主制備、純化和標(biāo)記；超敏ECL發(fā)光試劑盒，批號(hào)P0018S，購自碧云天；RABV熒光抗體，批號(hào)526056，購自FDI；TMB顯色液（ELISA HRP顯色用），批號(hào)110718181121,購自碧云天；PVDF膜，批號(hào)1620177，購自BIO-RAD；酚試劑，批號(hào)P1393226，購自 Sigma；臺(tái)盼藍(lán)，批號(hào) RNBG4319，購自Sigma；RABV G蛋白抗原定量ELISA試劑盒，批號(hào)RD20190628，上海青賽生物科技有限公司自主研發(fā)和制備；胰酶，批號(hào)1957852，購自Gibco ；L-谷氨酰胺（純度99.5%），批號(hào)170815，購自無錫美迪生物；碳酸氫鈉（純度99.3%），批號(hào)10180102，購自四川金山；硫酸慶大霉素，批號(hào)HS201804，購自湖北久碩；酒石酸鉀（純度99%），批號(hào)P10419，購自damas-beta；丙酮（純度99.9%），批號(hào)P1402539，購自GENERAL-REAGNT。

1.3 儀器

mini-PROTEAN Tetra cell蛋白電泳儀，BIORAD；BIO-5000Plus凝膠掃描儀，中晶；Amersham Imager 680發(fā)光成像儀，美國GE；CO2培養(yǎng)箱，ThermoHERACELL240i；CKX53倒置光學(xué)顯微鏡，OLYMPVS；CKX53/U-RFL-T倒置熒光顯微鏡，OLYMPVS；SC604生物安全柜，Baker；eyftpcyml500孵化器，依愛；R1全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，OLYMPVS；AccuSizer 780粒度儀，美國PSS；CR22N連續(xù)流離心機(jī)，HITACHI；GENESYS10S UV-VIS紫外分光光度計(jì)，Thermo；NanoDropone超微量紫外可見光分光光度計(jì)，Thermo。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 原代雞胚成纖維細(xì)胞制備

取活性良好的10日齡雞胚（血管清晰可見、氣室透亮，蛋殼無裂縫且旋轉(zhuǎn)有胎動(dòng)）500枚，取出胚胎，胚胎去頭去內(nèi)臟放入廣口瓶中（45枚/瓶）；PBS清洗胚胎3次；用剪刀將胚胎剪碎成2～3 mm3組織塊；PBS清洗2～3次；將其移至1 000 mL三角瓶，用0.125%胰酶進(jìn)行消化，按每個(gè)雞胚4～5 mL用量加入胰酶，蓋好三角瓶蓋，放入36.5～37.5 ℃水浴鍋消化20 min，然后輕輕取出，倒去胰酶上清液；加入胎牛血清至終濃度10%終止消化；棄去上清液，PBS漂洗2次；吸管輕輕吹散消化后組織塊，加入細(xì)胞生長液充分混勻，靜置3 min后收集上清液，再次吹散組織塊收集上清液至無組織塊為止；細(xì)胞懸液用細(xì)胞生長液定容至40 L過濾后細(xì)胞計(jì)數(shù)備用。

1.4.2 病毒培養(yǎng)

RABV Flurry HEP株懸浮接種（感染復(fù)數(shù)MOI=0.01）原代雞胚成纖維細(xì)胞，充分混勻后分裝至40層細(xì)胞工廠；34 ℃培養(yǎng)24 h，換細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)；待細(xì)胞病變80%，收取上清液并繼續(xù)加入新的細(xì)胞維持液培養(yǎng)2 d；再收集第二次收獲液，將兩次收獲液混合后于4 ℃儲(chǔ)藏備用。

1.4.3 澄清

將收獲液充分混勻并平均分為5份（每份20 kg）。安裝連續(xù)流離心機(jī)，設(shè)置上樣速度為700 mL/min，分別在離心力為0 g、4 530 g、8 050 g、12 600 g和21 260 g條件下對(duì)5份收獲液進(jìn)行澄清處理。充分混勻每份澄清液并取樣，用于后續(xù)檢測使用。

1.4.4 光學(xué)顯微鏡鏡檢

取 0 g、4 530 g、8 050 g、12 600 g和 21 260 g的離心后樣品各10 mL，分別用30 kD截留量超濾離心管濃縮10倍；再分別吸取濃縮后樣品與臺(tái)盼藍(lán)溶液按體積比1∶1充分混勻，作用30 s；吸取樣品10 μL于一次性細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，置于光學(xué)顯微鏡下（目鏡10倍，物鏡10倍）觀察并拍照。

1.4.5 粒度儀檢測

用純化水清洗粒度儀管路，分別取0 g、4 530 g、8 050 g、12 600 g和21 260 g離心后樣品20 mL，將檢測的顆粒物直徑范圍設(shè)置為0.50～25 μm，共檢測18種不同粒徑大小的顆粒物數(shù)量。

1.4.6 RABV滴度測定（直接熒光免疫染色法）

用DMEM對(duì)病毒樣品進(jìn)行10倍系列稀釋至10-6，每個(gè)稀釋度取10 μL加入96微孔板中，每稀釋度接種6個(gè)復(fù)孔。加入已消化制成1.5×105～2.5×105個(gè)/mL的BSR細(xì)胞懸液（90 μL/孔），置34 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h；培養(yǎng)后取出96微孔板加入丙酮洗滌一次，靜置1 min后傾倒，再加入丙酮，放-20 ℃冰箱1 h；倒去丙酮，用PBS洗滌3次，晾干；加入RABV熒光抗體，置37 ℃孵育1 h；用PBS洗滌3次，晾干；熒光顯微鏡下觀察并記錄陽性孔數(shù)。

1.4.7 RABV G蛋白定量ELISA

將抗原試劑盒置于室溫平衡30 min，將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋至工作濃度。按說明書將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至合適倍數(shù)，并將樣品稀釋至檢測范圍內(nèi)。每次試驗(yàn)設(shè)空白孔，將稀釋后的樣品、標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稀釋液分別加入對(duì)應(yīng)孔，每孔100 μL，加封口膜，輕輕震蕩混勻，放入37 ℃微生物培養(yǎng)箱中孵育1 h。取出板，用洗滌液洗板5次，拍干。每孔加100 μL酶標(biāo)抗體工作液，加封口膜，放入37 ℃恒溫箱中孵育30 min。取出板，用洗滌液洗板5次，拍干。每孔加TMB顯色液（ELISA HRP顯色用）50 μL，封口膜封板后放入37 ℃恒溫箱中孵育15 min。每孔加終止液50 μL，輕輕震蕩混勻，用酶標(biāo)儀于波長450 nm處讀數(shù)。以標(biāo)準(zhǔn)品抗原含量為Y軸，吸光度值為X軸作散點(diǎn)圖，用EXCEL軟件進(jìn)行二項(xiàng)式回歸，得回歸方程。將待測樣品的吸光度值代入回歸方程即可計(jì)算出G蛋白的含量。

1.4.8 可溶性總蛋白含量測定

分別采用Lorry法和UV值法對(duì)可溶性總蛋白含量進(jìn)行測定。

Lorry法：取2.5 g氫氧化鈉和12.50 g碳酸鈉充分溶解到注射用水中并定容至100 mL作為甲液待用；取0.50 g酒石酸鉀充分溶解到注射用水中并定容至50 mL，另取0.25 g硫酸銅充分溶解到注射用水中并定容至30 mL，將兩液混合作為乙液待用。開始實(shí)驗(yàn)前，取20 mL甲液、100 mL乙液和5 mL注射用水充分混勻作為丙液。取6支試管，依次加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL，分別用注射用水定容至1.0 mL，再分別加入1.0 mL丙液，充分混勻，室溫放置10 min，快速加入4.0 mL酚試劑并混勻，室溫放置30 min，顯色后采用紫外分光光度法，在波長650 nm處測定吸光度，以第一管為空白對(duì)照，校零，測各管650 nm的OD值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確量取一定體積約含50 μg蛋白質(zhì)的待檢樣品于試管中，加入1 mL注射用水，再加入1 mL丙液充分混勻，室溫放置10 min。快速加入4 mL酚試劑混勻，室溫放置30 min。顯色后按照紫外分光光度法，在波長650 nm處測定吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果須滿足R2≥0.98，同一個(gè)樣本兩個(gè)平行孔A值大/小≤0.120，兩個(gè)有效參數(shù)即為成立。

UV值法：選擇超微量紫外分光光度計(jì)的蛋白檢測模塊。分別吸取不同離心力條件下的澄清液樣品2 μL于加樣臺(tái)處檢測樣品中可溶性蛋白含量。

1.4.9 Western Blot

分別取0g、4 530 g、8 050 g、12 600 g和 21 260 g澄清條件下樣品48 μL與12 μL的5倍濃縮上樣緩沖液充分混勻，沸水中變性處理10 min后冰浴備用；分別取2 μL處理后樣品上樣；進(jìn)行恒壓電泳，電壓為100 V，時(shí)間為90 min；電泳完成后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜電壓為120 V，時(shí)間為50 min；1%牛血清白蛋白（BSA ）4 ℃封閉過夜；用HRP標(biāo)記的RABVG蛋白單克隆抗體常溫孵育2 h；TBST緩沖液TBST漂洗3次；加入HRP-羊抗兔IgG抗體，常溫下于水平搖床上孵育45 min；TBST漂洗3次；加入超敏ECL發(fā)光試劑，曝光檢測結(jié)果。

1.4.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Graph Pad Prism 6對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P＞0.05為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。*表示P＜0.05，**表示0.001＜P＜0.01，***表示P＜0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同澄清離心力對(duì)可視顆粒的去除情況

100倍光學(xué)顯微鏡下觀察不同澄清離心力條件下收獲液中可視顆粒的數(shù)量見圖1。如圖1所示，與未澄清的病毒收獲液（0 g）或4 530 g澄清后樣品相比，當(dāng)澄清離心力達(dá)到或超過8 050 g以后，收獲液中可視的顆粒物數(shù)目明顯減少，尤其大粒徑顆粒物。而12 600g和21 260g兩組的澄清收獲液中可視顆粒物的數(shù)目差異不大。

圖1 不同離心力澄清液鏡下圖

2.2 不同離心力澄清收獲液中顆粒數(shù)統(tǒng)計(jì)

為了定量分析不同澄清離心條件下顆粒物的去除情況，分別將不同離心力的澄清收獲液通過粒度儀統(tǒng)計(jì)顆粒物數(shù)量。如圖2所示，與未澄清病毒液相比，不同離心力條件下澄清液中的顆粒物均顯著減少，且隨著離心力增大，樣品中顆粒物被去除得也越徹底，但是當(dāng)離心力達(dá)到8 050 g以后，顆粒物數(shù)量減少趨勢減緩，尤其是離心力達(dá)到12 600 g，顆粒物總數(shù)幾乎不再減少（P=0.573 5）。

圖2 不同離心力下澄清收獲液的顆粒數(shù)濃度統(tǒng)計(jì)

2.3 不同澄清離心力對(duì)總蛋白的影響

如圖3A和3B所示，無論是Lorry法還是UV值法的檢測結(jié)果都表明，不同離心力條件下的澄清液中總蛋白含量均沒有顯著變化。

圖3 不同離心力澄清液蛋白含量

2.4 不同澄清離心力對(duì)病毒滴度影響

為了檢測不同離心力條件對(duì)澄清收獲液中具有完整結(jié)構(gòu)的RABV病毒顆粒數(shù)量的影響程度，分別對(duì)不同離心力的澄清收獲液做RABV滴度（lgCCID50）檢測，結(jié)果如圖4顯示。隨著離心力的增大，RABV滴度（lgCCID50）呈緩慢下降趨勢，與澄清前相比，當(dāng)離心力達(dá)到12 600 g以后，病毒滴度下降顯著（P＜0.05）。

2.5 不同澄清離心力對(duì)G蛋白回收率的影響

G蛋白是刺激機(jī)體產(chǎn)生抗RABV特異性中和抗體的關(guān)鍵蛋白[3]，分別通過Western Blot和定量ELISA兩種方法檢測不同離心力條件下澄清液樣品中RABVG蛋白的回收率情況。

圖4 不同離心力下的澄清液RABV滴度

2.5.1 Western Blot檢測結(jié)果

RABV G蛋白的分子量為60～70 kDa[4]。Western Blot結(jié)果（圖5A）表明，各離心力條件下澄清液樣品均在50～75 kDa區(qū)域中呈現(xiàn)單一條帶。通過軟件ImageJ對(duì)各條帶灰度值分析，結(jié)果見圖5B，各組澄清液中G蛋白的含量均無顯著性差異。

2.5.2 ELISA定量結(jié)果

如圖6所示，隨著離心力的增大，澄清液中抗原量呈緩慢下降趨勢。與未澄清樣品相比，當(dāng)離心力≥8 050 g時(shí)，抗原含量顯著減少。

在病毒收獲液離心澄清工藝中，影響固體顆粒物去除效率的主要因素有離心力和離心時(shí)間。對(duì)于連續(xù)流離心澄清工藝而言，離心機(jī)的離心腔體積固定，樣品離心時(shí)間和上樣速度成反比。因此，離心力和上樣速度是影響連續(xù)流澄清工藝中雜質(zhì)去除的關(guān)鍵參數(shù)。單從顆粒物去除率角度考量，離心力越大，離心時(shí)間越長，顆粒物的去除則越徹底。但是，對(duì)于病毒收獲液的澄清工藝，則應(yīng)在盡可能多的去除雜質(zhì)顆粒的同時(shí)更多地保留病毒顆粒；而且，基于產(chǎn)能要求，應(yīng)盡量在有限的時(shí)間內(nèi)處理更多樣品。因此，在連續(xù)流離心澄清工藝開發(fā)中，往往將上樣速率直接設(shè)定在設(shè)備允許的上限區(qū)間，而重點(diǎn)通過實(shí)驗(yàn)來篩選合適的離心力。

圖5 不同離心力的澄清液Western Blot鑒定結(jié)果

為了確定合理的離心力，一方面，要監(jiān)測粒徑大于目標(biāo)病毒 RABV 粒子 [（60～80）nm×（160～200 nm）][5]的顆粒物去除情況，如本研究中將粒徑大于500 nm的顆粒物作為檢測對(duì)象，當(dāng)這些顆粒物的去除率趨于穩(wěn)定時(shí)，說明繼續(xù)增大離心力則可能造成病毒粒子損失；另一方面，要系統(tǒng)分析抗原損失情況。最終，要綜合兩方面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定一個(gè)合理的離心力作為凍干人用狂犬病疫苗（雞胚成纖維細(xì)胞）的澄清離心參數(shù)。

對(duì)于狂犬病疫苗，G蛋白是最主要的免疫原蛋白[6-8]。在RABV的培養(yǎng)過程中主要產(chǎn)生兩種結(jié)構(gòu)類型的G蛋白，一種是位于RABV粒子表面的以三聚體形式存在的G蛋白[9-10]，另一種是游離型G蛋白單體[11]。研究表明，三聚體G蛋白的免疫原性高于單體游離G蛋白[12]。對(duì)于凍干人用狂犬病疫苗（雞胚成纖維細(xì)胞）澄清工藝開發(fā)，最大限度回收結(jié)構(gòu)完整的病毒粒子具有重要意義。由于沒有合適的抗體區(qū)分兩種存在形式的G蛋白，在本研究的抗原回收率評(píng)價(jià)過程中，既通過Western Blot和ELISA檢測G蛋白總量，也通過檢測病毒滴度間接判斷具有三聚體結(jié)構(gòu)的G蛋白的總量。篩選能夠區(qū)分單體和三聚體G蛋白的特異性抗體以及相應(yīng)檢測方法的建立將是未來重點(diǎn)研發(fā)的方向，這對(duì)于狂犬病疫苗工藝開發(fā)以及客觀評(píng)價(jià)疫苗質(zhì)量具有重要意義。

3 結(jié)論

凍干人用狂犬病疫苗（雞胚成纖維細(xì)胞）收獲液的最佳澄清離心力為8 050 g，當(dāng)離心力超過8 050 g，病毒滴度和抗原含量將顯著降低，而可溶性蛋白總量沒有顯著降低。本試驗(yàn)從大顆粒物雜質(zhì)去除和有效抗原回收兩個(gè)方面系統(tǒng)地研究了人用狂犬病疫苗（雞胚成纖維細(xì)胞）連續(xù)流澄清工藝的澄清效果，為大規(guī)模生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支持。