董允豪 金 月 崔成都 樸明淑*

（1、延邊大學(xué) 吉林省轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與胚胎工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉133002 2、吉林省龍井市林業(yè)局草原管理站，吉林 龍井133400）

SOS 法是2010 年 Atwater等[1]學(xué)者開發(fā)的一種動(dòng)物胰島分離方法，認(rèn)為該方法與傳統(tǒng)的膠原酶法相比，有以下優(yōu)點(diǎn)具有常溫或低溫下進(jìn)行、可保證胰島的完整性、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。2009 年Hilling 等[2]學(xué)者在進(jìn)行人類和豬胰腺胰島分離過程中，發(fā)現(xiàn)收集到的胰腺中，近46%的胰腺呈充血狀態(tài)，且這些處于充血狀態(tài)的胰腺在酶消化法分離的產(chǎn)量明顯下降，尤其在豬的胰腺分離過程中。因此，充血對動(dòng)物胰腺胰島分離具有一定的影響。那么，充血在SOS 法分離胰腺胰島有何影響，未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以屠宰豬胰腺為試驗(yàn)材料，采用SOS 法對充血和未充血狀態(tài)的胰腺進(jìn)行胰島的分離提純試驗(yàn)，為開發(fā)新的胰島分離提純方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料本試驗(yàn)取充血和非充血屠宰豬胰腺各5 例，均由延吉豬屠宰場提供。

1.1.2 主要試劑PBS 緩沖液、RPMI-1640 培養(yǎng)液、無水葡萄糖、Hanks、Histopaque-1077 胎牛血清、青鏈霉素、吖啶橙AO、溴化乙啶EB、DTZ、臺盼藍(lán)等。

1.1.3 主要儀器病理組織包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、攤片機(jī)、烘片機(jī)、超凈工作臺、電子天平、離心機(jī)、光學(xué)顯微鏡數(shù)碼圖像采集系統(tǒng)(BH-2) 、CO2 恒溫培養(yǎng)箱、體式顯微鏡、酶標(biāo)儀、實(shí)體顯微鏡等。

1.2 方法

圖1 屠宰豬胰腺HE×200 A：未充血胰腺；B：充血胰腺

1.2.1 胰腺的獲取、運(yùn)輸及取材屠宰場放血致死后，剖腹迅速摘取胰腺放入含有雙抗的PBS 的保溫壺中，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行胰島分離（熱缺血時(shí)間控制在10 min 以內(nèi)，冷缺血時(shí)間控制在30 min 以內(nèi)。取部分胰腺組織放入10%福爾馬林固定用于石蠟切片制作。

1.2.2 豬胰腺的HE 染色取材固定，制作石蠟組織切片，HE染色，顯微鏡下觀察并照相。

1.2.3 基于SOS 法的豬胰島分離純化采用Enck K（2017）所介紹試驗(yàn)方法，分別對充血和未充血胰腺，進(jìn)行豬胰島的分離純化、并計(jì)算出胰島產(chǎn)量、純度、存活率及、的鑒定、計(jì)數(shù)及胰島素刺激指數(shù)(SI）。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析本試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用mean±SD 表示，P<0.05 具有差異顯著性，P<0.01 具有差異極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 充血和非充血屠宰豬胰腺的組織學(xué)特征

圖2 屠宰豬胰島純化前、后DTZ 染色（×100）

光鏡下，未充血屠宰豬胰腺分為內(nèi)分泌腺和外分泌腺，外分泌腺占胰腺的絕大部分。胰島發(fā)育較完全，胰島輪廓清晰，呈圓形或橢圓形，而充血屠宰豬胰腺外分泌腺和內(nèi)分泌腺分界不清，組織間隙擴(kuò)大，組織的嗜酸性增強(qiáng)，且大部分細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮現(xiàn)象（如圖1）。

2.2 基于SOS 法的屠宰豬胰島的形態(tài)特點(diǎn)

基于SOS 法分離的屠宰豬胰島被DTZ 染成猩紅色，多呈圓形或橢圓形，對胰島純化前后進(jìn)行染色對比，純化前含有較多的胰島碎片和外分泌細(xì)胞碎片，純化后細(xì)胞碎片明顯減少，胰島純度提高。細(xì)胞壓片后胰島外ECM 保留完好（如圖2）。

2.3 采用SOS 法分離提純充血和非充血屠宰豬胰腺胰島效果比較

在高糖濃度為500 mmol/L 下，采用SOS 法分別分離提純充血和未充血胰腺胰島。未充血胰腺平均產(chǎn)量為5840±625 個(gè)/g，純度為93.8±0.9%，刺激指數(shù)為1.93±0.18，存活率為95%（如表1）。

表1 SOS 法和膠原酶法分離提出胰島

3 討論

基于SOS 法的胰島分離方法是分離胰島的一種新方法，與膠原酶灌注分離胰島相比，SOS 法具有在常溫或低溫下進(jìn)行減緩細(xì)胞的凋亡速率、能保證胰島的完整性、分離過程中不產(chǎn)生對胰島有害的物質(zhì)、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[1]。本試驗(yàn)在未充血屠宰豬胰腺的SOS 法分離中獲得平均產(chǎn)量為5840±625 個(gè)/g、純度為93.8±0.9%、刺激指數(shù)為1.93±0.18、存活率為95%的較好的效果，且分離出的胰島形態(tài)均呈圓形或橢圓形，胰島表面光滑，符合胰島移植的形態(tài)學(xué)要求，但在充血胰島中未能分離出胰島，說明充血胰島不適用于SOS 法。因此，在今后的試驗(yàn)中應(yīng)注意分離提純前對試驗(yàn)材料的篩選。

關(guān)于充血胰島，Hilling 等[2]學(xué)者在膠原酶法分離提純胰島的試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，充血的人類和豬胰腺中內(nèi)分泌含量較高，且分離提純的胰島產(chǎn)量相比未充血胰島低，因此推測處死動(dòng)物的某環(huán)節(jié)（如豬屠宰過程中的電擊等）導(dǎo)致動(dòng)物的血壓升高，使胰腺充血所致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，未充血屠宰豬胰腺內(nèi)、外分泌腺部界限清晰，外分泌腺占胰腺的絕大部分，胰島輪廓清晰，呈圓形或橢圓形，而充血屠宰豬胰腺外分泌腺和內(nèi)分泌腺分界不清，組織間隙擴(kuò)大，組織的嗜酸性增強(qiáng)，且大部分細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮現(xiàn)象。充血胰腺的這種組織學(xué)變化特點(diǎn)，表明胰腺由于充血導(dǎo)致水腫，使組織間隙擴(kuò)大，同時(shí)充血導(dǎo)致一些物質(zhì)的分泌導(dǎo)致胰腺構(gòu)成細(xì)胞的損傷。