付亞娟，陳紅豆，高夢迪，許笑晴，張慧敏，張文靜

1(廊坊師范學院 生命科學學院，河北 廊坊，065000)2(廊坊師范學院 河北省食藥用菌資源高值利用技術創(chuàng)新中心，河北 廊坊，065000)

黃曲霉(Aspergillusflavus)是一種腐生型好氧真菌，它易污染玉米、花生、棉花、小麥等農作物，影響其產量及品質[1]。同煙曲霉一樣，黃曲霉感染也能引起人鼻竇炎、膿毒性關節(jié)炎和系統(tǒng)性感染等一系列侵襲性疾病[2-3]。某些黃曲霉菌株還產生黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)，它主要包括AFB1、AFB2、AFG1和AFG24種類型，其中AFB1的毒性最強，具有致癌和致突變作用[1]。若奶牛攝入AFB1，1%～2%AFB1在奶牛體內會轉化為AFM1，且AFM1主要通過牛奶排出[4]。牛奶和奶制品存在AFM1同樣危害人類的健康，因此AFB1和AFM1被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構分別列為1類和2B類致癌物[5]。全面闡明黃曲霉致病及產毒分子機制，對控制黃曲霉感染和減輕黃曲霉毒素污染農產品均具有重要理論和實際意義。

黃曲霉毒素生物合成途徑的分子調控機制已研究得較為清楚[6]。除了溫度、培養(yǎng)基、水分活度、碳源、產毒和不產毒黃曲霉菌株雙重培養(yǎng)等外部因素[7-10]，黃曲霉毒素的生物合成還受到特異性轉錄因子和全局性轉錄因子的調控。AflR是調控黃曲霉毒素生物合成的特異性正調控因子，負責激活黃曲霉毒素生物合成基因簇的大部分基因表達[11-12]。近年來，越來越多的全局性轉錄因子已被證實參與調控黃曲霉毒素的生物合成，如LaeA[13]、LaeA同源蛋白Lael1[14]、LaeB[15]、Rum1[16]、mtfA[17]、Homeobox轉錄因子htf2[18]和HexA[19]。由此可見，黃曲霉毒素生物合成是一個多層次、多維度復雜的調控系統(tǒng)，可能涉及更多未知轉錄因子的調控。

2017年，OAKLEY等[20]首次報道一個新的全局轉錄因子McrA，并證實其參與調控構巢曲霉雜色曲霉素的生物合成，而雜色曲霉素是合成黃曲霉毒素最重要的前體物質。黑曲霉McrA對某些次級代謝產物合成起到正調控作用，而對某些次級代謝產物合成表現(xiàn)為負調控作用[21]。黃曲霉基因組存在McrA的同源基因，McrA是否參與黃曲霉毒素生物合成的調控目前尚不清楚。因此，本研究通過反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)克隆黃曲霉AfMcrA，并對其編碼蛋白的基本特征、保守結構域、亞細胞定位、二級結構和功能進行預測分析，旨在為將來深入探究黃曲霉AfMcrA的生物學功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種材料

黃曲霉(Aspergillusflavus)，廊坊師范學院生命科學學院史振霞副教授饋贈，該菌株從河北廊坊九州具有典型褐腐病的鴨梨果實中分離；感受態(tài)細胞EscherichiacoliTrans10，北京全式金生物技術有限公司。

1.2 實驗試劑

Omega真菌DNA提取試劑盒，上海索萊寶生物科技有限公司；真菌RNA提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒、氨芐青霉素鈉，生工生物工程(上海)股份有限公司；質粒小量提取試劑盒、DNA Marker，天根生化科技(北京)有限公司；PCR擴增試劑盒、pTOPO-Blunt平末端克隆試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒，北京艾德萊生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃曲霉RNA的提取及cDNA的合成

采用真菌RNA提取試劑盒分離黃曲霉總RNA。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度。將高質量的RNA反轉錄合成cDNA第1鏈，其反應體系為5×TRUE Reaction Mix 4 μL，Oligo(dT) 1 μL，總RNA 400 ng，補RNase-free H2O至20 μL。反應程序為42 ℃、20 min； 85 ℃、5 s。

1.3.2AfMcrA的克隆

根據(jù)黃曲霉AfMcrA的cDNA序列(Accession No. XM_002380888.1)，設計并合成一對特異性引物McrAF和McrAR，如表1所示，PCR擴增AfMcrA基因。其反應體系如下：2×A8 PCR Master Mix 12.5 μL，cDNA 1 μL，McrAF和McrAR(10 μmol/L)各0.5 μL，補加ddH2O至25 μL。PCR程序為94 ℃、4 min；94 ℃、30 s，60 ℃、20 s，72 ℃、45 s，30 個循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。純化的PCR產物直接克隆到平末端克隆載體pTOPO-Blunt，轉化EscherichiacoliTrans10感受態(tài)細胞。將菌落PCR鑒定的5個陽性轉化子送上海生工進行測序，測序引物為載體通用引物M13F和M13R。

表1 本研究所有引物及序列Table 1 Primers used in the study

1.3.3AfMcrA的外顯子和內含子分析

采用真菌DNA提取試劑盒分離黃曲霉基因組DNA。以DNA為模板，McrAF和McrAR為特異引物進行PCR擴增。PCR產物經(jīng)克隆測序獲得AfMcrA的基因組DNA序列(gDNA)。采用DNAMAN軟件對AfMcrA的gDNA和cDNA序列進行比對，以確定AfMcrA的內含子和外顯子構成。

1.3.4 AfMcrA的生物信息學分析

利用一系列在線工具對AfMcrA的理化性質、親疏水性、信號肽、跨膜結構域、亞細胞定位、保守結構域、二級結構等進行預測(表2)。DNAMAN對不同來源McrA進行多重序列比對。Mega 5.1構建系統(tǒng)發(fā)育NJ樹(Bootstrap method并設定Bootstrap值為1 000)。

表2 AfMcrA的生物信息學預測項目及在線工具Table 2 Items predicted and online tools

1.3.5AfMcrA的表達分析

采用直徑為5 mm的打孔器在黃曲霉菌落邊緣打取菌餅，并等量接種到PD培養(yǎng)基中，28 ℃分別振蕩培養(yǎng)2、4、6、8 d。分別提取不同培養(yǎng)時間黃曲霉總RNA，反轉錄合成cDNA第1鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析不同培養(yǎng)時間AfMcrA的相對表達量。反應體系為20 μL，其中2× SYBR Green qPCR Mix 10 μL，cDNA模板1 μL，正向和反向引物(5 μmol/L)各1 μL。PCR程序為94 ℃、 2 min； 94 ℃、 10 s， 60 ℃、 30 s， 40個循環(huán)。AfMcrA及內參基因18S rRNA[22]的引物序列見表1。每個樣本設置3個重復，反應結束后繪制熔解曲線。采用2-ΔΔCt計算AfMcrA的相對表達量，用Excel和SPSS進行柱形圖繪制和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 AfMcrA的克隆

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測黃曲霉RNA的完整性，28S條帶亮度約為18S的2倍(圖1-a)，表明所提取RNA的質量較好。以RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，McrAF和McrAR為特異引物，PCR擴增獲得1條清晰、明亮條帶，其大小與AfMcrA的理論值基本一致(圖1-b)。經(jīng)克隆測序，獲得了黃曲霉AfMcrA的cDNA序列，全長1 101 bp。

泳道M-DNA Marker Ⅲ；泳道a1-黃曲霉總RNA；泳道b1～b2-AfMcrA的cDNA序列擴增產物a-黃曲霉RNA;b-黃曲霉AfMcrA基因的PCR擴增圖1 黃曲霉RNA和AfMcrA的cDNA序列擴增Fig.1 A. flavus RNA and amplification of AfMcrA cDNA fragment

2.2 AfMcrA基因的內含子和外顯子分析

以黃曲霉gDNA為模板，McrAF和McrAR為特異引物，PCR擴增出1條1 200～2 000 bp的條帶(圖2)?？寺y序獲得AfMcrA的gDNA序列為1 448 bp。采用DNAMAN軟件對AfMcrA的cDNA和gDNA序列進行比對，發(fā)現(xiàn)AfMcrA由3個內含子和4個外顯子組成，且內含子的剪切位點均符合真核生物的5′-GT和3′-AG原則(圖3)。

泳道M-DNA Marker Ⅲ；泳道1～2-AfMcrA的gDNA序列擴增產物圖2 AfMcrA的gDNA序列擴增Fig.2 Amplification of gDNA fragment of AfMcrA

2.3 AfMcrA編碼蛋白的生物信息學分析

2.3.1AfMcrA的基本特征預測分析

AfMcrA共編碼366個氨基酸(圖3)。生物信息學預測，AfMcrA是1個分子質量為39.82 kDa，理論等電點為8.97，不穩(wěn)定的親水蛋白質，且不含信號肽和跨膜結構域。

黑三角形(▲)-與Zn2+結合的半胱氨酸殘基：橫線(-)-2個半胱氨酸之間的氨基酸殘基的數(shù)目及種類圖3 AfMcrA的基因結構及編碼的氨基酸序列Fig.3 Gene structure and encoded amino acid sequence of AfMcrA

SMART預測，AfMcrA包含1個GAL4鋅指蛋白結構域(氨基酸殘基位點117～165)，且氨基酸序列Cys-X2-Cys-X6-Cys-X10-Cys-X2-Cys-X6-Cys(圖3)符合Zn(Ⅱ)2Cys6型轉錄因子典型的保守基因序列特征，其中6個半胱氨酸殘基共結合2個Zn2+。

AfMcrA含有45個潛在的磷酸化位點，其中絲氨酸磷酸化位點29個，蘇氨酸磷酸化位點7個，酪氨酸磷酸化位點9個。

2.3.2 AfMcrA亞細胞定位及結構預測

PredictNLS預測AfMcrA亞細胞定位于細胞核中，這與其作為轉錄因子相一致。AfMcrA二級結構預測顯示，無規(guī)則卷曲最豐富(84.43%)；其次是延伸鏈(6.83%)和α-螺旋(6.56%)；β-轉角最少，僅占2.19%。

2.3.3 AfMcrA無序化特征分析

無序化特征預測，發(fā)現(xiàn)AfMcrA包含4處無序區(qū)(氨基酸殘基位點1～142，182～186，190～247，249～366)，共323個無序氨基酸殘基(圖4)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，脯氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸和精氨酸在AfMcrA無序區(qū)含量較為豐富，特別是脯氨酸和絲氨酸。

圖4 AfMcrA的無序化特征預測Fig.4 Disordered feature prediction of AfMcrA

2.4 AfMcrA的多序列比對分析

AfMcrA與不同曲霉McrA均具有較高同源性(83.42%～99.73%)，表明曲霉屬真菌McrA具有高度保守性。圖5展示了曲霉McrA的多序列比對結果，發(fā)現(xiàn)其具有完全保守的Zn(Ⅱ)2Cys6DNA結合結構域，但部分McrA存在18～22個氨基酸缺失。進一步分析發(fā)現(xiàn)，缺失的22個氨基酸恰好由1個內含子編碼。

2.5 AfMcrA的系統(tǒng)進化分析

采用Mega 5.1構建曲霉轉錄因子McrA的系統(tǒng)發(fā)育樹，青霉McrA為外類群。由圖6可知，黃曲霉AfMcrA與米曲霉McrA聚在同一進化枝上，親緣關系較近，這與米曲霉和黃曲霉同屬曲霉屬黃綠組的分類地位相一致。

2.6 AfMcrA的表達分析

qRT-PCR結果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，AfMcrA的相對表達量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。以培養(yǎng)2 d的AfMcrA表達量為校正樣本，AfMcrA在培養(yǎng)6 d時表達量最高，為2 d的15.79倍；培養(yǎng)4 d時AfMcrA的表達量為2 d的3.24倍(圖7)。

圖5 不同曲霉McrA蛋白的多序列比對Fig.5 Multiple sequence alignment of different McrA注：黑色區(qū)域表示比對相似度為100%的序列；灰色區(qū)域表示比對相似度≥75%的序列；黑色圓點線顯示不同曲霉McrA的Zn(Ⅱ)2Cys6雙核簇DNA結合結構域；黑方框顯示不同曲霉McrA的氨基酸缺失位點

圖6 AfMcrA的系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of AfMcrA

圖7 不同培養(yǎng)時間AfMcrA的相對表達分析Fig.7 Relative expression of AfMcrA in different culture periods注：不同字母表示在P<0.05水平上有顯著差異

3 結論與討論

鋅指蛋白作為真核生物中數(shù)量最多的一類轉錄因子，在基因表達調控、細胞分化、信號轉導等方面發(fā)揮著重要作用[23]。根據(jù)保守基序的差異，鋅指轉錄因子主要分為Cys2His2(C2H2)、Cys4(C4)和Cys6(C6)3種類型[24]。C6轉錄因子只發(fā)現(xiàn)于酵母和真菌中，包含一個Zn(Ⅱ)2Cys6雙核簇結構域，參與碳和氮化合物的利用、次級代謝產物的合成、無性和有性發(fā)育等生物學過程[25-26]。2017年，OAKLEY等[20]首次報道1個新的C6型全局轉錄因子McrA，并在構巢曲霉、土曲霉和變灰青霉中證實了McrA參與眾多次級代謝產物合成的調控。

以構巢曲霉McrA為查詢序列進行Blastp分析，發(fā)現(xiàn)黃曲霉NRRL3557中的C6轉錄因子(XP_002380929.1)與構巢曲霉McrA具有較高的同源性(59.57%)，但黃曲霉McrA的相關研究目前尚未見報道。因此，本研究通過RT-PCR克隆了黃曲霉AfMcrA，cDNA全長1 101 bp，編碼366個氨基酸。AfMcrA具有典型保守基序Cys-X2-Cys-X6-Cys-X10-Cys-X2-Cys-X6-Cys，屬于Zn(Ⅱ)2Cys6鋅簇蛋白家族[24]。已有研究揭示黃曲霉基因組編碼349個Zn(Ⅱ)2Cys6蛋白，其中94個蛋白僅有一個C6域，159個蛋白僅有fungi-specific TF域，96個蛋白具有C6域和TF域[24]。AfMcrA屬于黃曲霉中只含有C6域的鋅指蛋白，這與構巢曲霉McrA[20]和黑曲霉McrA[21]都只具有保守的C6結構域相一致。PredictNLS預測AfMcrA定位于細胞核內，推測AfMcrA可能在細胞質中合成，然后在核定位信號(YCRRRKIRCSGFE，氨基酸殘基位點125～137)的介導下被轉運到細胞核中發(fā)揮轉錄因子的調控作用。系統(tǒng)進化分析表明，黃曲霉AfMcrA與米曲霉McrA聚在同一進化枝上，這與Aspergillusoryzae屬于A.flavus的同一居群的分類地位相一致。相對于其他曲霉，AfMcrA與AspergillusarachidicolaMcrA的親緣關系更近，這與MOORE等[27]研究結果相一致，A.arachidicola與A.flavus是由共同的原始祖先進化而來，它們之間具有較高的形態(tài)、遺傳和化學相似性。

AfMcrA具有高比例的無規(guī)則卷曲(84.43%)、無序氨基酸殘基(88.25%)和磷酸化位點(12.30%)，暗示AfMcrA的生物學功能可能具有多樣性。AfMcrA與參考序列AspergillusflavusNRRL3357的McrA相比，缺失22個氨基酸，且這22個氨基酸恰好由1個內含子編碼，表明黃曲霉AfMcrA可能存在內含子保留型可變剪切[28]。已有研究表明，內含子在基因表達中起著調控作用，通過選擇性剪切使單基因表達多種蛋白，從而豐富蛋白多樣性[29]。但黃曲霉AfMcrA是否通過可變剪切形成不同蛋白，執(zhí)行不同生物學功能有待研究。

qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，AfMcrA的相對表達量在培養(yǎng)6 d時達到峰值，分別為2 d和8 d的15.79倍和14.76倍，說明黃曲霉在生長前期AfMcrA表達量逐漸升高，而后由于養(yǎng)料的消耗和有害代謝產物的積累，菌絲自溶或生長減緩，導致生長后期AfMcrA表達量急劇下降。絲狀真菌很多次生代謝產物是在衰退期合成，推測AfMcrA可能參與黃曲霉某些次級代謝產物合成的調控。構巢曲霉和黑曲霉McrA作為全局轉錄因子參與次級代謝產物合成的調控[20-21]，可以為這一觀點提供有力的支撐。值得注意的是，構巢曲霉McrA在雜色曲霉素的生物合成中發(fā)揮調控作用[20]，而雜色曲霉素是合成黃曲霉毒素的重要前體物質。AfMcrA是否直接或間接參與黃曲霉毒素生物合成的調控是后續(xù)著重要解決的科學問題。目前我們正采用農桿菌介導的真菌遺傳轉化法(agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT)對黃曲霉AfMcrA進行敲除和過表達，揭示其與黃曲霉毒素產生的關系，進一步完善黃曲霉毒素合成錯綜復雜的調控網(wǎng)絡，旨在為制定黃曲霉毒素防控的策略提供理論依據(jù)。