沈興旺，李婉麒，趙創(chuàng)謙，崔鑫儒，陳紫穎，湯柳茜，張匯，熊智強，艾連中，夏永軍

(上海理工大學 醫(yī)療器械與食品學院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

牦牛常年生活在海撥3 000 m以上的高寒地帶，采食天然牧草，當?shù)乜諝狻⑺?、草場均未受污染，因此所產(chǎn)牛奶是純天然的綠色食品，被譽為“天然綠色濃縮奶”[1]。發(fā)酵乳是由鮮乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵而成，不僅改善了營養(yǎng)品質(zhì)，還產(chǎn)生了生物活性物質(zhì)，具有較好的益生功能[2]。牦牛發(fā)酵乳有益于消化，可以治療輕微腹瀉，還有抑菌、鎮(zhèn)靜的功能，其營養(yǎng)價值高于普通牛奶，是一款潛在的保健飲料。過去牦牛乳產(chǎn)品加工標準缺失，牦牛酸奶的加工一直停留在初級階段[3]，在實際生產(chǎn)、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)，牦牛發(fā)酵乳普遍存在因為凝膠脆弱導致組織狀態(tài)破壞及乳清析出等問題，嚴重影響了牦牛發(fā)酵乳的品質(zhì)。

益生菌可改善體內(nèi)微生物菌群平衡，對宿主健康產(chǎn)生積極作用。發(fā)酵乳被認為是將益生菌傳遞到人體內(nèi)的最理想載體，發(fā)酵乳添加益生菌后，他們之間保健作用和營養(yǎng)價值互相交織在一起，可完美結(jié)合起來。本研究所采用的益生菌菌種為實驗室自行篩選得到，并且具有優(yōu)良的生理活性，LactobacillusplantarumAR501具有優(yōu)良的抗氧化活性，能夠顯著緩解煎炸油引起的肝臟氧化應激損傷[4-5]；LactobacillusplantarumAR495具有緩解骨質(zhì)疏松功能，并具有較好的胞多糖合成能力；LactobacillussalivariusAR809具有防齲齒，緩解細菌性咽炎的活性，并具有較好的胞多糖合成能力[6]。本研究主要探討添加益生菌株對發(fā)酵乳發(fā)酵過程中理化性質(zhì)、質(zhì)構(gòu)、流變學特性及感官品質(zhì)的影響[7]，為開展高品質(zhì)牦牛發(fā)酵乳的研究和提升青藏高原牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供一定理論依據(jù)和技術(shù)指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛乳，青海高原之寶牦牛乳業(yè)有限公司；植物乳桿菌L.plantarumAR501(保藏編號CGMCC 13910)、植物乳桿菌L.plantarumAR495(保藏編號CGMCC 14004)、唾液乳桿菌L.salivariusAR809(保藏編號CGMCC 17206)，-80 ℃凍存管保存；普通酸奶發(fā)酵劑YO-MIX 883(保加利亞乳桿菌Lactobacillusbulgaricus、嗜熱鏈球菌Streptococcusthermophiles)，丹尼斯克(中國)有限公司；改良MRS培養(yǎng)基(g/L)：牛肉浸出粉10、酪蛋白胨10、酵母浸出粉5、葡萄糖20、三水乙酸鈉8.3、檸檬酸氫二胺2、K2HPO42、MgSO4·7H2O 0.58、MnSO4·H2O 0.25、吐溫-80 1；ZnSO4、NaNO3、K2HPO4·3H2O、ZnSO4、CaCl2、HCl、三氯乙酸、NaCl、H2SO4、磷鎢酸、無水Na2SO4、KOH、NH4HCO3(均為分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；白砂糖，南京甘汁園糖業(yè)。

1.2 儀器與設備

3-18K型冷凍離心機, 德國Sigma公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化；KBF240型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，德國Binder公司；PB-10型pH計，瑞士梅特勒-托利多公司；FOSS 8400全自動凱氏定氮儀，瑞典FOSS分析儀器有限公司；WNB7-45型快速升溫水浴鍋，德國Memmert有限公司；PL2002型電子天平，瑞士Metrler Toledo公司；LDZF-30KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安；TA.XTPlus物性測試儀，英國Stable Micro System公司；DHR-3旋轉(zhuǎn)流變儀，美國TA儀器；APV100高壓均質(zhì)機，丹麥APV 公司；BCD-278TAJ型冰箱，海爾集團公司。

1.3 試驗方法

菌株培養(yǎng)：將菌株從-80 ℃取出，菌種繼代于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長，接種量為1%。

酸奶制備：新鮮牛乳，加入質(zhì)量分數(shù)為7%的白砂糖，42 ℃攪拌水合，均質(zhì)機均質(zhì)，巴氏殺菌，冷卻至42 ℃，接種量為2%，42 ℃培養(yǎng)，4 ℃冷藏，破乳。

酸度測定：采用滴定酸度法，以吉爾涅爾度(°T)表示[8]。

持水力測定：參照劉亞瓊等[9]的方法，將離心條件修改為轉(zhuǎn)速8 000×g，時間10 min，溫度15 ℃。

pH：實驗室pH計測定。

固形物含量測定：利用減壓干燥法，真空干燥箱、扁形鋁制或玻璃制稱量瓶、干燥器內(nèi)附有效干燥劑，天平感量為0.1 mg。

脂肪測定：按GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》進行測定。

蛋白質(zhì)水解：Foss 8400全自動凱氏定氮儀，準確稱取1 g樣品，進行凱氏定氮測含氮總量(total nitrogen，TN)。參考MANE等[10]、SAHINGIL等[11]和LIU等[12]的方法并略加修改，分別測定pH 4.6-可溶性氮(soluble nitrogen，SN)、12%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)-SN和5%精對苯二甲酸(pure terephthalic acid，PTA)-SN含量。

質(zhì)構(gòu)分析：探頭型號TA25/1 000；平端直徑50 mm；測試前探頭下降速度10.0 mm/s；測試速度1.0 mm/s；測試后探頭回程速度1.0 mm/s；時間5.00 s；測試距離15.00 mm；觸發(fā)力5 g[13]。

黏度測定、流變學特性分析：采用小振幅頻率掃描法測定發(fā)酵乳的流變特性。選用DHR-3旋轉(zhuǎn)流變儀，直徑40 mm的不銹鋼平板探頭，平板與底面的間隙為1 mm，測試溫度控制在25 ℃。

感官評價：根據(jù)GB 19302—2010《食品安全國家標準發(fā)酵乳》的要求，參考酸奶感官評分標準，結(jié)合牦牛發(fā)酵乳特有的感官特性，制定評分標準。

1.4 數(shù)據(jù)分析

重復試驗3次，試驗結(jié)果以平均值±標準差來表示，用分析軟件SPSS 19.0對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，顯著性檢驗采用 ANOVA 程序中的Duncan法，P<0.05即差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同益生菌株發(fā)酵乳特性比較

2.1.1 不同益生菌對牦牛發(fā)酵乳酸度及pH值的影響

發(fā)酵過程中，不同益生菌對牦牛發(fā)酵乳發(fā)酵過程酸度有顯著影響。如圖1-a所示，隨著發(fā)酵時間延長，益生菌配合普通發(fā)酵劑YO-MIX 883(益生菌混合發(fā)酵組)使得發(fā)酵乳酸度顯著提升，變化趨勢與普通發(fā)酵劑類似，發(fā)酵終點(6 h)酸度維持在70 °T左右。然而，3株益生菌單獨發(fā)酵酸度沒有達到理想的食用酸度，僅有20～40 °T，也就是說，在實驗設定的發(fā)酵時間內(nèi)，單獨益生菌不能成功發(fā)酵牦牛乳。與對照組相比，益生菌混合發(fā)酵組終點pH值略高，但是顯著低于益生菌單獨發(fā)酵組(圖1-b)。無論是單一菌種還是混合菌種，發(fā)酵階段將乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，酸度變化均呈現(xiàn)上升趨勢。

在冷藏過程中控制酸度的增加，對發(fā)酵乳的感官和品質(zhì)有著重要的影響，后酸化是活菌發(fā)酵乳產(chǎn)品面臨的重要問題[14]。在冷藏階段，益生菌混合發(fā)酵組酸度略有上升，而3株益生菌單獨發(fā)酵上升明顯(圖1-c)。冷藏4 d后，唾液乳桿菌AR809、植物乳桿菌AR501混合發(fā)酵制備的發(fā)酵乳酸度(100、 99 °T)顯著低于對照組(109 °T)以及植物乳桿菌AR495混合發(fā)酵組(107 °T)(P<0.05)。發(fā)酵乳制備過程中，隨著蛋白質(zhì)和脂肪的降解，發(fā)酵乳體系呈良好的酸堿緩沖狀態(tài)，因此，酸度變化與pH可能不太一致。冷藏過程中，益生菌混合發(fā)酵組制備的牦牛發(fā)酵乳pH略高于對照組(圖1-d)。從冷藏過程后酸化控制效果來看，AR809和AR501混合發(fā)酵效果較好。在冷藏階段，溫度的降低使酸度增長趨于緩和，潘紅梅等[15]研究表明，添加了植物乳桿菌的發(fā)酵乳在一定程度上酸度的增長變慢，植物乳桿菌和普通發(fā)酵菌相互作用，從而控制后酸化。

a-發(fā)酵過程中酸度變化;b-發(fā)酵終點pH值;c-冷藏期間酸度變化;d-冷藏期間pH值變化圖1 不同益生菌對牦牛發(fā)酵乳酸度及pH值的影響Fig.1 Effects of different probiotics on lactic acidity and pH of yak fermentation注:同一時間點不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 不同益生菌對牦牛發(fā)酵乳持水力的影響

持水力是酸奶的重要理化指標之一，直接影響酸奶的組織狀態(tài)[16]。牦牛發(fā)酵乳在冷藏前期(1～2 d)，發(fā)酵乳持水力呈上升趨勢，隨后趨于穩(wěn)定(圖2)。對冷藏第4天持水力顯著性分析表明，與對照組相比，AR809混合發(fā)酵制備的牦牛發(fā)酵乳持水力最高，達到74.54%，顯著高于其余益生菌發(fā)酵組(P<0.05)，表現(xiàn)為發(fā)酵乳質(zhì)地細膩，凝固性好，乳清析出少。人源唾液乳桿菌AR809較高的黏附性，使其在發(fā)酵乳中與普通發(fā)酵劑的相互作用下可以高效生長，保持了較高的持水力[6]。在相同冷藏條件下，AR809、AR495組的凝膠效果更強，乳蛋白膠體結(jié)合水的能力增強，菌體在冷藏期間緩慢生長，其持水力在冷藏后期有緩慢上升的趨勢。但是3株益生菌單獨發(fā)酵的牦牛發(fā)酵乳在發(fā)酵結(jié)束時未完全凝固，傾斜即發(fā)生破裂。

圖2 不同益生菌對牦牛發(fā)酵乳持水力的影響Fig.2 Effects of different probiotics on water holding capacity of yak fermented milk注：顯著性是所有的發(fā)酵組與對照組對比，***表示P<0.001

2.1.3 不同益生菌對牦牛發(fā)酵乳黏度的影響

發(fā)酵乳容易出現(xiàn)黏稠度低，顆粒感強，乳清析出等問題[17]。發(fā)酵過程中，蛋白凝乳增加了發(fā)酵乳的黏稠度。如圖3所示，不同益生菌對牦牛發(fā)酵乳黏度有顯著性影響(P<0.05)。冷藏1 d，益生菌混合發(fā)酵組與對照組黏度差異不大，僅AR809混合發(fā)酵組有顯著性差異。隨著冷藏時間的延長，益生菌混合發(fā)酵組的黏度顯著增加，尤其是AR809與AR495混合發(fā)酵組，而對照組黏度變化趨于穩(wěn)定。冷藏4 d，AR809、AR495混合發(fā)酵組黏度分別達到3.11、2.38 Pa·s，為冷藏1 d的1.82、1.47倍。組內(nèi)比較顯示，冷藏4 d后益生菌混合發(fā)酵組制備的牦牛發(fā)酵乳黏度顯著高于對照組，其中AR890混合發(fā)酵組黏度最高，為對照組的1.98倍。對于益生菌單獨發(fā)酵組，由于酸化程度較弱，牦牛乳凝乳失敗，因此發(fā)酵乳黏度始終處于較低水平。

綜上所述，唾液乳桿菌AR809在冷藏過程中能夠較好地控制后酸化程度，從而不影響發(fā)酵乳口感，并且通過增加持水力和黏度來提高發(fā)酵乳的穩(wěn)定性。因此，后續(xù)實驗選用AR809作為益生菌發(fā)酵劑，配合普通發(fā)酵劑制備牦牛益生菌發(fā)酵乳，考察發(fā)酵乳蛋白降解、流變等特性。

圖3 在剪切速率為10 s-1時不同益生菌對牦牛發(fā)酵乳黏度的影響Fig.3 Effect of different probiotics on the viscosity of yak fermented milk at a shear rate of 10 s-1

2.2 唾液乳桿菌AR809在牦牛發(fā)酵乳中特性的研究

2.2.1 唾液乳桿菌AR809提高牦牛發(fā)酵乳蛋白水解程度

實驗以牦牛乳為原料，利用唾液乳桿菌AR809以及普通發(fā)酵劑制備牦牛酸奶，考察添加AR809對牦牛發(fā)酵乳品質(zhì)的影響。實驗結(jié)果如表1所示，AR809在發(fā)酵及冷藏期間產(chǎn)生胞外多糖等代謝產(chǎn)物，形成品質(zhì)較好凝乳的同時，牦牛發(fā)酵乳固形物含量稍有提升，但是沒有顯著性，達到23.81%。冷藏結(jié)束后AR809混合發(fā)酵組與普通發(fā)酵劑組的總氮和總脂肪含量沒有顯著性差異。但是蛋白降解分析表明，與對照組相比，AR809混合發(fā)酵組12%TCA-SN和5%PTA-SN指標有顯著提高，分別提高了78.22%、40.78%，而pH 4.6-SN無顯著變化。pH 4.6-SN代表的是蛋白水解廣度[10]，表征的是中肽和小肽的含量，12%TCA-SN代表蛋白質(zhì)水解深度[11]。磷鎢酸溶液是一種辨別力很強的蛋白質(zhì)沉淀劑，在5%PTA磷鎢酸溶液中，所有蛋白質(zhì)都會沉淀，只有游離氨基酸(賴氨酸和精氨酸除外)和一些短鏈縮氨酸能溶解在其中。因此通常用5%PTA-SN來表征游離氨基酸含量[12]。結(jié)果表明，添加唾液乳桿菌AR809進行牦牛發(fā)酵乳制備，能有效加強發(fā)酵乳蛋白降解，提高發(fā)酵乳中肽及游離氨基酸水平。

表1 不同牦牛發(fā)酵乳樣品理化指標Table 1 Physical and chemical indexes of different yak fermented milk samples

2.2.2 唾液乳桿菌AR809改善牦牛發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性

對牦牛發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性進行對比分析，包括第一循環(huán)硬度、黏附性、第二循環(huán)硬度、內(nèi)聚性、彈性、膠黏性、咀嚼性、凝膠強度、黏附力等方面，實驗結(jié)果如表2所示。唾液乳桿菌AR809混合發(fā)酵組能夠顯著改善牦牛發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性。在所測定指標中第一循環(huán)硬度、黏附性、第二循環(huán)硬度、彈性、膠黏性、咀嚼性有顯著提升，其中，咀嚼性、黏附性以及彈性提升最為明顯，達到20.42 mJ、21.34 N·mm、14.39 mm，分別為對照組的2.88、2.75、1.68倍。2組酸奶的內(nèi)聚性、凝膠強度以及黏附力指標沒有顯著變化。AR809菌株產(chǎn)生的胞外多糖等代謝產(chǎn)物，使得發(fā)酵乳具有較好的拉絲性和黏稠性，對質(zhì)構(gòu)特性有顯著影響，表現(xiàn)為較高的表觀黏度和硬度。這與蔣萌蒙等[18]的研究結(jié)果是相同的，劉文文等[13]的實驗中第一循環(huán)硬度、彈性也是顯著提高的，與本實驗的結(jié)論一致。

表2 不同牦牛發(fā)酵乳樣品質(zhì)構(gòu)特性Table 2 Texture characteristics of different yak fermented milk samples

2.2.3 流變學特性分析

采用流變儀分析不同發(fā)酵乳樣品的流變特性，結(jié)果如圖4-a所示。添加唾液乳桿菌AR809對牦牛發(fā)酵乳剪切流變行為無顯著影響，對照組和AR809混合發(fā)酵組的表觀黏度都隨剪切速率的增加而降低，表現(xiàn)出剪切稀化的流體行為，屬于假塑性流體。然而，添加AR809能夠改變黏度曲線的形狀，無論是在低剪切速率還是高剪切速率下，AR809混合發(fā)酵組都顯示出比對照組樣品明顯更高的表觀黏度。這可能是AR809的加入有利于酪蛋白的凝乳，從而增加發(fā)酵乳黏度[19]。

對不同樣品的黏彈性進行分析，結(jié)果表明，對照組和AR809混合發(fā)酵組的儲能模量(G′)顯著大于損耗模量(G″)[20]，表現(xiàn)出弱的黏彈性凝膠特性，并且G′和G″均對頻率有輕微的依賴性(斜率相同)(圖4-b)。隨著AR809的加入，G′和G″均呈現(xiàn)上升趨勢，儲能模量的增大，AR809的加入有利于酪蛋白的凝乳結(jié)構(gòu)。損耗角正切(tanδ)考慮到了儲能模量和損耗模量的貢獻(tanδ=G″/G′)，它可以提供有關(guān)材料黏彈性的更多信息。tanδ較低(阻尼系數(shù))是指材料彈性成分的更強貢獻，可有助于增加結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性，從而減少與其他基質(zhì)(例如唾液)的溶混性[21]。tanδ較低的樣品比阻尼系數(shù)較高的樣品更粗大；雖然所有樣品的G′曲線顯示出相似的頻率依賴性(相似的斜率)，但tanδ曲線在樣品中仍能表現(xiàn)出差異。包含AR809的發(fā)酵乳表現(xiàn)出明顯更高的儲能模量和較高的tanδ值，這表明其凝膠結(jié)構(gòu)比對照的凝膠結(jié)構(gòu)更多，使得牦牛發(fā)酵乳有厚重口感的同時兼有些許順滑[22](圖4-c)。流變學特性分析與前面質(zhì)構(gòu)變化研究具有一致性。

2.2.4 感官評價

建立感官評價小組[8],篩選實驗室人員培訓，由10名品評員組成酸奶感官評價小組。參考TAKUNRAT等[23]并根據(jù)牦牛發(fā)酵乳特點建立感官描述詞(表3)。由感官評價小組對2組發(fā)酵乳樣品進行感官分析，最終的感官評分如圖5所示。結(jié)果顯示，添加唾液乳桿菌AR809能夠顯著提高牦牛發(fā)酵乳適口性、組織狀態(tài)、黏附性以及酸甜比，表現(xiàn)為AR809混合發(fā)酵組凝固均勻，表面無氣泡、龜裂現(xiàn)象，質(zhì)地評分較高；而對照組發(fā)酵組有少量乳清析出，適口性較差。其余指標如顆粒感、奶香味以及糊口感無顯著差異。

a-牦牛發(fā)酵乳表觀黏度曲線；b-儲存模量彈性模量掃描曲線；c-損耗角正切掃描曲線圖4 牦牛發(fā)酵乳流變學特性Fig.4 Rheological properties of yak fermented milk

表3 感官評價評分標準Table 3 Sensory evaluation scoring standard

圖5 原味和益生菌牦牛發(fā)酵乳感官評價雷達圖Fig.5 Radar chart of sensory evaluation of raw and probiotic yak fermented milk

3 結(jié)論

前期研究表明，唾液乳桿菌AR809能夠有效緩解細菌性咽炎，并且具有良好的胞外多糖合成能力。本文研究表明AR809能夠應用于牦牛發(fā)酵乳制備，顯著改善牦牛發(fā)酵乳品質(zhì)。添加唾液乳桿菌AR809，能夠有效控制牦牛發(fā)酵乳冷藏過程的后酸化，并且提高發(fā)酵乳黏度以及持水力，加強牦牛乳蛋白的水解。質(zhì)構(gòu)和流變分析表明，AR809能夠提高牦牛發(fā)酵乳彈性和咀嚼性，提高發(fā)酵乳表觀黏度，使得凝乳細膩均勻。感官分析進一步表明，AR809能夠提高牦牛發(fā)酵乳的適口性和組織狀態(tài)。本文研究結(jié)果表明，添加唾液乳桿菌AR809能夠有效改善牦牛發(fā)酵乳品質(zhì)，并且為牦牛發(fā)酵乳帶來更好的生理活性。