李鑫，涂宗財(cái),3*，沙小梅，張露，李軍，李忠瑩

1(江西師范大學(xué) 國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌，330022)2(江西師范大學(xué) 江西省淡水魚高值化利用工程技術(shù)研究中心，江西 南昌，330022)3(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330047)

明膠是一種蛋白來源的生物材料，具有良好的成膜性，生物相容性和商業(yè)可獲得性，用明膠制備的可食用膜具有原料來源廣泛、安全性高及環(huán)境可降解的優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前食品包裝領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-2]。明膠膜的顯著缺點(diǎn)是生物活性較低，阻礙了其在食品包裝領(lǐng)域的應(yīng)用，通過添加天然來源的改性劑以提升明膠膜的生物活性是一種有效的明膠膜改性方法[3-5]。精油通常提取自天然的植物和香料，被認(rèn)為是食品工業(yè)中安全的食品添加劑，將精油作為明膠膜的改性劑，可以提高明膠膜的生物活性。TEIXEIRA等[5]用丁香精油、大蒜精油和牛至精油增強(qiáng)蛋白膜的抗氧化性和抗菌性；MARTUCCI等[6]選擇牛至精油和薰衣草精油作為增強(qiáng)明膠膜生物活性的添加劑；TONGNUANCHAN等[7]通過添加柑橘屬的精油獲得明膠復(fù)合膜的抗氧化性。前期研究還發(fā)現(xiàn)，精油不僅能影響明膠復(fù)合膜的生物活性，同時(shí)影響明膠復(fù)合膜的物理性能，例如增強(qiáng)明膠復(fù)合膜的抗水性和延展性等[8]。許多研究者認(rèn)為，在制備明膠膜的過程中添加精油會(huì)影響膜的氣味品質(zhì)，降低消費(fèi)者對明膠膜的接受程度[8-10]。據(jù)我所知，目前還沒有關(guān)于可食用膜氣味評價(jià)的相關(guān)報(bào)道。

生姜精油、大蒜精油、肉桂精油、薄荷精油和百里香精油是常見的香料精油，它們均具有特殊的氣味和較強(qiáng)的抗菌性。本實(shí)驗(yàn)的目的是在明膠膜的制備過程中添加上述5種精油，通過研究精油-明膠復(fù)合膜的抗菌性、膜厚、水蒸氣透過性，機(jī)械性能，顏色，光學(xué)性能和微觀結(jié)構(gòu)來評價(jià)不同精油對復(fù)合膜生物活性和物理性質(zhì)的影響，同時(shí)結(jié)合復(fù)合膜的感官評價(jià)，選擇出最適合的精油作為明膠膜的生物改性劑。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

魚明膠，凍力為270，由中國江蘇吉利鼎生物科技公司提供。

吐溫80，美國Sigma公司；生姜精油、大蒜精油、肉桂精油、薄荷精油、百里香精油，中國御美化妝品公司；大腸桿菌[Escherichiacoli(ATCC25922)]，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；金黃色葡萄球菌[Staphylococcusaureus(ATCC25923)]，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與設(shè)備

質(zhì)構(gòu)儀(TA.XT Plus)，英國Stable Micro Systems；色差儀(CR-10)，日本Konica Minolta Optics；數(shù)字電子測微器(293-230)，日本Mitutoyo；紫外可見分光光度計(jì)(Nanodrop200)、全反射紅外光譜分析儀(Nicolet 6700)，美國Thermo Fisher；掃描電子顯微鏡(S-3400N)，日本Hitachi。

1.3 用不同精油制備復(fù)合膜

將質(zhì)量濃度為80 g/L的魚明膠在60 ℃條件下加熱90 min，直至完全融化。甘油能起到塑化的作用，將10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的甘油加入混合液中，此混合液為A液。將精油和吐溫80以1∶1(mL∶g)的比例進(jìn)行混合，此混合液為B液。將B液加入到A液中進(jìn)行混合，得到混合液C液，使得精油在C液中的質(zhì)量濃度為10 g/L。將C液在室溫下(25±2) ℃用磁力攪拌30 min。最后，將8 mL的C液澆鑄在塑料培養(yǎng)皿上(90 mm×90 mm)，直至自然風(fēng)干。將取下來的膜放在溫度為(25±2) ℃、相對濕度為(50±5)%的環(huán)境下進(jìn)行保存[11]。復(fù)合膜的配置比例如表1所示。

表1 不同精油制備復(fù)合膜的配制比例Table 1 The preparation proportion of composite film incorporated with different essential oils

1.4 抗菌性

選擇革蘭氏陰性菌E.coli和革蘭氏陽性菌S.aureus對復(fù)合膜的抗菌性進(jìn)行評價(jià)。在實(shí)驗(yàn)前，將復(fù)合膜放在紫外燈下照射3 h，其他物品均在121 ℃滅菌 20 min。選擇Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基作為細(xì)菌培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)菌的初始濃度為1×105CFU/mL。用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算培養(yǎng)液的細(xì)菌含量(lg CFU/mL)。將160 mg的膜樣品加入LB培養(yǎng)基中，控制組中不添加任何膜樣品。所有的樣品在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h[12]。所有的樣品均重復(fù)3次。膜的抑菌能力通過公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

lgCFU/mLreduction=lgCFU/mLcontrol-lgCFU/mLfilm

(1)

1.5 物理性能

1.5.1 膜厚

膜厚用數(shù)顯電子測微器進(jìn)行測量。在每個(gè)膜樣中隨機(jī)選擇10個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測量，并用這10個(gè)點(diǎn)來計(jì)算膜厚的平均值。膜厚被用來計(jì)算拉伸強(qiáng)度，水蒸氣透過性和不透光性[10]。

1.5.2 水蒸氣透過性(water vapor permeability，WVP)

膜的水蒸氣透過性是根據(jù)ASTM E96-95[13]的方法進(jìn)行測量。在玻璃杯(直徑為40 mm，深為25 mm)中裝入干燥的CaCl2，然后用樣品膜對玻璃杯進(jìn)行密封。將玻璃杯放入含飽和水蒸氣的密閉容器中，調(diào)節(jié)環(huán)境溫度為30 ℃。每隔1 h測量1次玻璃杯的質(zhì)量，直至玻璃杯的質(zhì)量沒有顯著變化時(shí)，停止測量。膜的水蒸氣透過性通過公式(2)進(jìn)行計(jì)算：

(2)

式中：w代表玻璃杯增長的質(zhì)量，g；l是膜的厚度，m；A是膜封口的面積,m2；t是玻璃杯質(zhì)量變化的時(shí)間，s；P2-P1是膜兩側(cè)的蒸氣壓差(4 244.9 Pa，30 ℃)。每個(gè)樣品重復(fù)4次。

1.5.3 機(jī)械性能

參照ASTM D882[14]的方法，用質(zhì)構(gòu)儀對膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率進(jìn)行測定。將膜樣品裁剪成20 mm寬和50 mm長的條狀，固定在儀器手柄的兩端，設(shè)置手柄兩端的間距為30 mm，調(diào)節(jié)測試速度為1 mm/s，促發(fā)力為5 g。每個(gè)膜樣品測試10次，用以計(jì)算拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率的平均值。拉伸強(qiáng)度(tensile strength，TS)和斷裂伸長率(elongation at break，EAB)通過公式(3)和公式(4)計(jì)算：

(3)

(4)

式中：Fmax是將條狀膜樣品分離需要的最大負(fù)載，N；A是樣品膜的切面面積，m2；L0是膜的初始拉伸長度(L0=30 mm)；ΔL是膜斷裂后的變化長度，mm。

1.5.4 顏色

膜的顏色用色差儀進(jìn)行測量，通過L*(亮度)，a*(紅/綠)，和b*(黃/藍(lán))和總色差ΔE四個(gè)參數(shù)表示顏色差異。總色差ΔE的計(jì)算如公式(5)所示：

(5)

式中：L，a和b是標(biāo)準(zhǔn)白板的參數(shù)(L=92.56，a=-0.49，b=-0.25)，每個(gè)膜樣品測試8次計(jì)算平均值[15]。

1.5.5 不透光性

用紫外可見分光光度計(jì)測量膜的不透光性，膜不透光性的計(jì)算如公式(6)所示：

(6)

式中：A600是膜在波長為600 nm時(shí)的吸光度；x是膜的厚度,mm[16-17]。

1.5.6 掃描電鏡分析

通過掃描電鏡分析樣品膜的切面微觀結(jié)構(gòu)，將膜樣品固定在銅板上，對樣品膜表面進(jìn)行噴金處理，以利于導(dǎo)電，在20 kV的加速電壓下進(jìn)行拍照[18]。

1.6 感官評價(jià)

將樣品膜分別放在白色干凈的盤子上，分別對樣品膜進(jìn)行編號(hào)。所有測試者的年齡均在20～63歲，對測試者進(jìn)行描述性感官訓(xùn)練，測試者依據(jù)樣品的等級(jí)給出0～8分的評價(jià)。感官評定標(biāo)準(zhǔn)如表2所示，分?jǐn)?shù)越低，代表膜的性能越好。每組樣品分別測試5次求得平均值[19]。

表2 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Scoring criteria of sensory evaluation

1.7 數(shù)據(jù)分析

用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方差分析和多重比較分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，當(dāng)P<0.05被視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果和分析

2.1 抗菌性

添加不同精油復(fù)合膜對革蘭氏陽性菌S.aureus和革蘭氏陰性菌E.coli的抗菌能力如圖1所示。由圖1可以看出，所有復(fù)合膜對革蘭氏陽性菌的抗菌性比對革蘭氏陰性菌的抗菌性強(qiáng)；添加不同來源的精油對復(fù)合膜抗菌性的影響不同，生姜精油復(fù)合膜、大蒜精油復(fù)合膜和肉桂精油復(fù)合膜的抗菌性強(qiáng)于薄荷精油復(fù)合膜和百麗香精油復(fù)合膜。EL-BAROTY等[20]認(rèn)為，生姜油中的β-倍半甲烯(β-sesquiphellandrene)、石竹烯(caryophyllene)和姜烯(zingiberene)是其有效抗菌成分，肉桂精油中的肉桂醛(cinnamaldehyde)和丁香酚(eugenol)是其有效抗菌成分；大蒜被證明對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和抗酸細(xì)菌都有抗菌性。SIVROPOULOU等[21]證明薄荷精油對8株革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌有抗菌作用；KARAPINAR等[22]和BEUCHAT等[23]認(rèn)為，肉桂精油、百里香精油對食源性微生物有廣泛的抗菌性。同種精油的抗菌性會(huì)存在較大差異，這是因?yàn)樘崛》绞讲町?、植物來源不同都?huì)造成精油中有效成分的差異。因此，在明膠膜中添加以上5種精油，均能有效抑制革蘭氏陽性菌S.aureus和革蘭氏陰性菌E.coli的生長。精油通過破壞微生物的細(xì)胞壁，滲入到細(xì)胞內(nèi)部，使細(xì)胞內(nèi)部蛋白失去活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌多了一層脂多糖成分，這層脂多糖能阻止油性成分(精油)在細(xì)胞膜上的聚集，降低油性成分(精油)對細(xì)胞壁的滲透作用，從而使得精油對革蘭氏陰性菌的抗菌能力減弱[24]?？梢娋涂咕鷱?fù)合膜對革蘭氏陽性菌的抗菌能力均強(qiáng)于對革蘭氏陰性菌的抗菌能力。

圖1 不同精油復(fù)合膜的抗菌能力Fig.1 The antimicrobial activity of composite film incorporated with different essential oils注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

2.2 膜厚

加入不同精油復(fù)合膜的厚度如表3所示?？刂平M膜顯示出最低的厚度，為61.00×10-3mm；添加精油后，復(fù)合膜的厚度均有所上升，但添加等量的不同種類的精油會(huì)顯示出不同的厚度，添加生姜精油、大蒜精油、肉桂精油、薄荷精油、百里香精油復(fù)合膜的膜厚分別為87.00×10-3mm，84.00×10-3mm，92.00×10-3mm，103.00×10-3mm，109.00×10-3mm(P<0.05)。在明膠膜中加入精油會(huì)影響明膠膜的厚度，因?yàn)榫蜁?huì)阻礙蛋白分子間的相互作用，形成松散的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致復(fù)合膜的厚度增加，而不同精油對明膠膜厚度的影響不同。AHMAD等[9]認(rèn)為，明膠和精油之間的生物相容性的差異導(dǎo)致了復(fù)合膜厚度的差異，明膠和精油之間生物相容性好，形成的復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)越緊密，膜厚也越低。復(fù)合明膠膜根據(jù)厚度從低到高排列依次是：大蒜精油復(fù)合膜，生姜精油復(fù)合膜，肉桂精油復(fù)合膜，薄荷精油復(fù)合膜，百里香精油復(fù)合膜，由此推斷精油明膠之間的相容性由好到差依次是：大蒜精油、生姜精油、肉桂精油、薄荷精油、百里香精油。膜的厚度是膜重要的基本性質(zhì)，膜厚與膜的水蒸氣透過性，拉伸強(qiáng)度和不透光性有關(guān)。

表3 不同精油復(fù)合膜的膜厚、水蒸氣透過性、拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長率和水溶解性Table 3 The thickness, water vapor permeability, tensile strength, elongation at break and water solubility of composite film incorporated with different essential oils

2.3 水蒸氣透過性

添加不同精油復(fù)合膜的水蒸氣透過性如表3所示。沒有添加精油明膠膜的水蒸氣透過性最低，為4.21×10-11g/(m·s·Pa)(P<0.05)，添加1%精油后，復(fù)合膜的水蒸氣透過性變低，但添加不同精油對復(fù)合膜水蒸氣透過性的影響不同。復(fù)合膜水蒸氣透過性的值從高到低依次是：百里香精油復(fù)合膜，薄荷精油復(fù)合膜，肉桂精油復(fù)合膜，生姜精油復(fù)合膜，大蒜精油復(fù)合膜。精油添加破壞了膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的緊實(shí)程度，使膜基質(zhì)變得松散，增加了膜與水蒸氣分子的接觸面積，從而使膜的水蒸氣透過性增加[25]。膜厚越厚，說明膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)越松散，水蒸氣分子越容易穿過膜，從而使膜的水蒸氣透過性增加。因此，復(fù)合膜的水蒸氣透過性反應(yīng)了復(fù)合膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的疏松程度，且復(fù)合膜的水蒸氣透過性值與膜的厚度成正比。

2.4 機(jī)械性能

添加不同精油復(fù)合膜的機(jī)械性能如表3所示，膜的機(jī)械性可以通過拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率2個(gè)指標(biāo)來評價(jià)。沒有添加精油的明膠膜具有最高的拉伸強(qiáng)度(51.98 MPa)和最低的斷裂伸長率(15.61%)；在添加了不同的精油后，復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度降低，斷裂伸長率上升；而百里香復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度(17.51 MPa)最低、斷裂伸長率最高(104.69%)。不同種類的精油對復(fù)合膜機(jī)械性能的影響不同。明膠膜是由長蛋白鏈維持其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，添加油滴會(huì)阻礙長鏈蛋白之間的相互作用，形成較短的蛋白鏈，導(dǎo)致膜的拉伸強(qiáng)度降低；同時(shí)，油滴的阻礙作用使膜形成了易于流動(dòng)的區(qū)域，導(dǎo)致膜的斷裂伸長率上升[26]。添加等量的精油制備復(fù)合膜，不同精油復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率表現(xiàn)出差異，這可能是精油與明膠相容性的差異造成的。當(dāng)精油與明膠的相容性較好時(shí)，形成復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)較為緊密，膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)不容易發(fā)生流動(dòng)，因此拉伸強(qiáng)度較高，斷裂伸長率較低；如果精油與明膠的相容性較差，則拉伸強(qiáng)度變低，斷裂伸長率較高。

2.5 水溶解性

添加不同精油復(fù)合膜的水溶解性如表3所示，控制組膜的水溶性值最低，不管添加哪種精油，都能使膜的水溶性值增大。生姜精油膜、大蒜精油膜、肉桂精油膜、薄荷精油膜和百里香精油膜的水溶性值分別為16.2%，15.05%，17.08%，18.23%，18.70%。純明膠膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)比較緊密，不容易被水滲透，復(fù)合膜中因?yàn)樘砑恿司偷木壒剩瑑?nèi)部結(jié)構(gòu)更為松散，增加了復(fù)合膜與水的接觸面積，使得復(fù)合膜的水溶性值增大[27]。

2.6 顏色和不透光度

添加不同精油復(fù)合膜的顏色如表4所示。膜的顏色通過L*、a*、b*和ΔE值來表示，膜的顏色是重要的外觀指標(biāo)。所有薄膜的L*值沒有顯著差異(88.38～90.47)；控制組膜具有最高的a*值(1.82)，最低的b*值(-4.20)；添加精油后，所有復(fù)合膜的a*值下降，b*值上升，肉桂精油復(fù)合膜具有最高的b*值和ΔE值。復(fù)合膜顏色的差異是由精油本身的顏色決定的，除肉桂精油復(fù)合膜外，所有復(fù)合膜都具有較好的亮度和外觀色澤，不同精油的顏色對復(fù)合膜顏色的影響不大。

由表4還可以知道，控制組膜具有最低的不透光性，為1.06；添加精油后，所有復(fù)合膜的不透光性增加。精油的散色作用會(huì)降低復(fù)合膜的透光性，從而使得膜的不透光性增加。復(fù)合膜不透光性的強(qiáng)弱與精油的添加量和添加種類有關(guān)：添加量越多，散光性越強(qiáng)，不透光性越強(qiáng)；精油與明膠的生物相容性越好，精油顆粒分散越均勻，散光性增強(qiáng)，不透光性增強(qiáng)。生姜精油膜的不透光度值最高，可能是因?yàn)樯团c明膠的生物相容性最好，在膜中的分散得更均勻，散光性最弱，從而不透光性最強(qiáng)。

表4 不同精油復(fù)合膜的顏色和不透光性Table 4 The color and opacity of composite film incorporated with different essential oils

2.7 掃描電鏡分析

添加不同精油復(fù)合膜的掃描電鏡的切面圖如圖2所示?？刂平M膜顯示出最緊實(shí)的切面結(jié)構(gòu)，添加精油后，所有復(fù)合膜的切面呈現(xiàn)出不同程度的松散狀態(tài)。掃描電鏡切面圖可以更直觀地觀察復(fù)合膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從各復(fù)合膜的切面形態(tài)可以觀察到，生姜精油復(fù)合膜和大蒜精油復(fù)合膜切面的松散程度最低，而百麗香精油復(fù)合膜的松散程度最高，肉桂精油復(fù)合膜和薄荷精油復(fù)合膜的松散程度處于中間。復(fù)合膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的松散程度與復(fù)合膜的其他性質(zhì)密切相關(guān)，松散程度越高，厚度越厚，水蒸氣透過性越高，拉伸強(qiáng)度越低，斷裂伸長率越高。

a-控制組膜；b-生姜精油復(fù)合膜；c-大蒜精油復(fù)合膜；d-肉桂精油復(fù)合膜；e-薄荷精油復(fù)合膜；f-百里香精油復(fù)合膜圖2 不同精油復(fù)合膜的掃描電鏡分析Fig.2 The SEM analysis of composite film incorporated with different essential oils

2.8 感官評價(jià)

不同精油制備復(fù)合膜的感官分析如圖3所示。復(fù)合膜感官評分的分值越低，說明復(fù)合膜的感官評價(jià)越好。膜厚、拉伸度和柔軟度是屬于觸覺的感官評價(jià)，百里香復(fù)合膜在膜厚、拉伸度和柔軟度的分值最高，其次是薄荷精油復(fù)合膜和肉桂精油復(fù)合膜，大蒜精油復(fù)合膜和生姜精油復(fù)合膜的分值較低。透明度、光滑度和顏色是屬于視覺的感官評價(jià)，5組復(fù)合膜在透明度上的差異很小，薄荷精油復(fù)合膜和百里香精油復(fù)合膜比生姜復(fù)合膜、大蒜精油復(fù)合膜和肉桂精油復(fù)合膜的光滑度差，而肉桂精油復(fù)合膜的顏色明顯比其他復(fù)合膜的顏色深，這與肉桂精油本身的顏色有關(guān)。在嗅覺感官評價(jià)中，大蒜精油復(fù)合膜和肉桂精油復(fù)合膜都有顯著的精油氣味，百里香精油復(fù)合膜的氣味稍弱，而生姜精油復(fù)合膜和薄荷精油復(fù)合膜的氣味最輕。AURELI等[28]認(rèn)為：雖然大多數(shù)精油可用于抑制食物來源的微生物的生長，但是必須考慮精油氣味對食物的影響。因此，對添加到明膠膜中的精油，要綜合考慮對復(fù)合膜的物理性能，視覺感受和氣味的影響。通過感官評價(jià)的結(jié)果可知，生姜精油復(fù)合膜的感官評價(jià)總得分最小，為16.3分，大蒜精油復(fù)合膜、肉桂精油復(fù)合膜、薄荷精油復(fù)合膜和百里香精油復(fù)合膜感官評價(jià)的分值依次為21.2分，23.77分，20.53分和27.23分。生姜精油復(fù)合膜的感官評價(jià)效果最好，因此，生姜精油最適合作為改性劑添加到明膠膜中。

圖3 不同精油制備復(fù)合膜的感官分析Fig.3 The sensory evaluation of composite film incorporated with different essential oils

3 小結(jié)

不同精油與明膠膜生物相容性的差異會(huì)導(dǎo)致復(fù)合膜功能性質(zhì)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異。添加生姜精油、大蒜精油和肉桂精油制備復(fù)合膜的抗菌性較強(qiáng)，且膜厚、水蒸氣透過性值、斷裂伸長率和水溶解性較低，拉伸強(qiáng)度較大，不透光性較高；通過感官評價(jià)分析，大蒜精油復(fù)合膜和肉桂復(fù)合膜的精油氣味較重，肉桂精油復(fù)合膜的顏色較深，均影響復(fù)合膜品質(zhì)，而生姜精油復(fù)合膜的感官評價(jià)最佳。生姜精油制備的復(fù)合膜具有較好的抗菌性和物理性質(zhì)，且沒有突出氣味，因此生姜精油是最適合的精油改性劑。