朱浩,管軍軍，劉雪,鄭建樟，冀旭陽，路新開

(河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州，450001)

在食品加工業(yè)中，通常添加蛋白質(zhì)、多糖等天然乳化劑建立穩(wěn)定的食品乳化體系。大豆分離蛋白(soy protein osolate，SPI)在乳狀液的形成中起重要作用，不僅具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，還具有良好的乳化性和穩(wěn)定性，其乳化性的本質(zhì)是蛋白質(zhì)中的親水、親油基團(tuán)吸附在乳液的油水界面上，形成外圍的聚合膜以防止油滴聚集，從而起到乳化穩(wěn)定效果[1]。KANAMOTO[2]研究發(fā)現(xiàn)，磷脂可以改變蛋白表面活性，對蛋白結(jié)構(gòu)和表面電荷進(jìn)行修飾，甚至將蛋白結(jié)合到磷脂分子形成的膠束或囊泡中去，通過磷脂與蛋白的協(xié)同作用形成穩(wěn)定的乳濁液。所以利用大豆蛋白和磷脂的交互作用及雙親作用，保持油水界面穩(wěn)定，制備穩(wěn)定的大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液[3-4]。

目前，體外消化模型在國內(nèi)外的應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)普遍。例如 HUR等[5]建立胃腸道體外模擬模型，研究了乳化液對方便面中脂質(zhì)消化的影響。CAPRIOOTI等[6]研究了大豆種子和大豆乳蛋白在體外模擬消化道消化過程中產(chǎn)生的潛在生物活性肽的鑒定。因?yàn)樗梢阅M人體胃腸道消化吸收過程來研究食物在口腔以及胃腸道中的消化吸收、結(jié)構(gòu)變化和成分釋放情況。所以選用更加貼合人體實(shí)際消化情況的胃腸體外消化模型，模擬消化中實(shí)際電解質(zhì)濃度以及蛋白酶的情況來設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)過程[7]。

植物乳桿菌是一類存在于人體胃腸道內(nèi)的益生菌群，具有調(diào)節(jié)免疫功能、腸道功能及保持腸道微生態(tài)平衡等作用[8-9]，同時廣泛存在于各類發(fā)酵食品如乳制品及葡萄酒中，有助于改善食品的風(fēng)味，提高營養(yǎng)價(jià)值。通過探究植物乳桿菌在胃腸體外消化模型中對穩(wěn)定的大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液穩(wěn)定性的影響，研究植物乳桿菌在食物消化過程中的作用，對食品工業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，鄭州市丹尼斯超市；大豆油(金龍魚精煉一級)，益海嘉里食品營銷有限公司；粉末磷脂(丙酮不溶物質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)，鄭州四維生物科技有限公司；植物乳桿菌,江蘇省蘇州市安琪酸奶發(fā)酵劑；胃蛋白酶(活性10 000 NFU/mg)、胰蛋白酶，生工生物工程(上海)股份有限公司；α-淀粉酶，盈芯生物科技(上海)有限公司；脂肪酶(活性20 000 U/g)，索萊寶；膽鹽，滬慧生物科技(上海)有限公司；KH2PO4(≥99.5%)、MgCl2(≥98%)等化學(xué)試劑均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；FA25高剪切分散乳化機(jī)，德國FLUKO公司；HH-4恒溫水浴鍋、85-2恒溫磁力攪拌器，河南智城科技發(fā)展有限公司；BH200生物顯微鏡,舜宇光學(xué)科技集團(tuán)有限公司；722N可見分光光度計(jì)，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；JP-100A-2高速多功能粉碎機(jī)，永康市久品工貿(mào)有限公司；DSX-30L手提式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

對參考文獻(xiàn)[10-11]的方法進(jìn)行改進(jìn)：選取優(yōu)質(zhì)大豆粉碎后過80目篩，采用索氏提取法對大豆粉末脫脂，將脫脂后的大豆粉末與蒸餾水以1∶10的質(zhì)量比混合攪拌，滴加2 mol/L的 NaOH調(diào)pH至8.0，同時50 ℃水浴加熱1 h，離心30 min(5 000 r/min)取上清液，滴加2 mol/L HCl調(diào)pH值至4.8后4 ℃冷藏過夜，次日離心50 min(5 000 r/min)，并調(diào)pH值至7.0，冷凍干燥即得SPI。

1.3.2 大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液的制備

建立水包油(oil/water，O/W)型及油包水(water/oil，W/O)型大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液的穩(wěn)定體系。根據(jù)參考文獻(xiàn)[12-14]和前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，O/W型乳液中各物質(zhì)質(zhì)量濃度為大豆分離蛋白20 g/L、磷脂10 g/L、蒸餾水800 g/L、大豆油200 g/L；W/O型乳液中各物質(zhì)質(zhì)量濃度為大豆分離蛋白20 g/L、磷脂10 g/L、蒸餾水400 g/L、大豆油600 g/L。

1.3.3 植物乳桿菌菌菌液的制備

使用MRS培養(yǎng)基[15]活化培養(yǎng)植物乳桿菌。將純化后的乳桿菌加入100 mL的MRS培養(yǎng)液中搖勻，置培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)24 h后放入冰箱中冷藏備用，此時活菌數(shù)為5×107CFU/mL。

1.3.4 唾液和胃液的制備

根據(jù)表1模擬消化液的組成成分[16]。母液電解質(zhì)以500 mL為標(biāo)準(zhǔn)配制，腸液以十二指腸液、膽液以及NaHCO3按照6∶3∶1的體積比配制。

表1 模擬胃腸道消化液的組成Table 1 Composition of simulated gastrointestinal digestive fluid

1.3.5 胃腸體外消化模型的建立

根據(jù)體內(nèi)消化的特點(diǎn)，參考付笑飛等[17-19]的方法，將反應(yīng)過程分為3個階段。首先模擬口腔，將100 mL的模擬唾液與100 mL的大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液置于錐形瓶中混合均勻，置于水浴恒溫振蕩器中振蕩反應(yīng)5 min(溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速95 r/min)，加植物乳桿菌組另需加入6 mL培養(yǎng)24 h的菌液；其次模擬胃，將200 mL的模擬胃液加入錐形瓶中；最后模擬腸道，向錐形瓶中加入400 mL的模擬腸液，錐形瓶始終置于水浴恒溫振蕩器中(溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速95 r/min)，模擬人體胃腸環(huán)境。

1.3.6 乳液的微觀結(jié)構(gòu)

取10 μL的樣品滴在載玻片上，觀察樣品的形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍片保存。

1.3.7 乳液的粒徑及電位測定

分別取樣測量粒徑以及電位，樣品稀釋100倍(0.05 mL樣品+4.95 mL蒸餾水)，設(shè)置儀器溫度為25 ℃。粒徑的乳液相對折射率設(shè)置為1.095(大豆油1.456與水相1.33的折射率之比)，測量乳液的粒徑和電位。

1.3.8 乳化活性、乳化穩(wěn)定性的測定

乳化活性的測定參考文獻(xiàn)[20]，取樣后立即用0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)溶液稀釋，用分光光度計(jì)(波長500 nm)測量吸光值計(jì)算乳化活性指數(shù)(emulsifying activity index,EAI)，靜置 30 min 后測定吸光值計(jì)算乳化穩(wěn)定指數(shù)(emulsifying stability index,ESI)，計(jì)算如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

(2)

式中:T,2.303；N,稀釋倍數(shù)；C,乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,g/mL；Φ,樣品中油相體積分?jǐn)?shù)；A0,0 min時吸光值；A30,30 min時吸光值.

1.3.9 活菌數(shù)的測量

加菌組每隔1 h取1 mL樣品，將樣品加入裝有9 mL無菌水的試管中，分梯度稀釋后，選用 10-5、10-6、10-7梯度的稀釋液在MRS培養(yǎng)基中涂布，37 ℃ 培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均取3次測定結(jié)果的平均值和誤差值。采用 Origin制圖，采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 活菌數(shù)變化

圖1為植物乳桿菌在O/W和W/O型大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液中的生長情況。如圖1所示，胃中植物乳桿菌的數(shù)量呈降低趨勢，而在小腸中菌數(shù)則不斷增加至7 h后呈基本穩(wěn)定趨勢。利用SAS軟件進(jìn)行單因素方差分析，W/O型乳液與O/W型乳液的菌數(shù)隨著時間的變化具有顯著差異(P<0.001)。植物乳桿菌更適合在水包油的體系中生長，乳液在0 min加入胃液之后pH值由7.0變至2.0，而乳酸菌最適生長pH值是5.5～6.0，植物乳桿菌在不利的生存條件下部分死亡，數(shù)量不斷減少；加入小腸液之后，可能是由于體系中的pH值適合植物乳桿菌的生長和植物乳桿菌利用其自身的黏附作用[21]，數(shù)量不斷增多。

a-模擬胃液；b-模擬腸液圖1 模擬胃腸消化液中植物乳桿菌數(shù)量的變化Fig.1 The number change of Lactobacillus plantarum in the simulasted gastrointestinal digestive fluid

2.2 乳液的微觀結(jié)構(gòu)和乳液粒徑的分析

圖2～圖4表示了O/W和W/O型大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液在消化液的作用下，對比加植物乳桿菌與不加植物乳桿菌的微觀結(jié)構(gòu)和粒徑變化情況。平均粒徑和粒徑分布反映了乳液體系中脂肪球體積大小以及均一程度，體積越小，均一程度越高，說明乳液穩(wěn)定性越好。從圖4可知，加菌乳液的粒徑整體大于不加菌乳液的粒徑，W/O型乳液的粒徑整體大于O/W型乳液的粒徑。結(jié)合顯微鏡觀察(圖2、圖3)，W/O型乳液的油滴明顯大于O/W型乳液中的油滴，并且乳液中被油滴包裹的蛋白被胃蛋白酶酶解后，失去蛋白的小油滴聚合后上浮導(dǎo)致胃液處理2 h后乳液粒徑減小，加入腸液后上浮的部分油滴再次進(jìn)入乳液開始分離成小油滴，粒徑減小，乳液的均一程度變高。利用SAS軟件進(jìn)行方差分析，O/W型乳液和W/O型乳液具有顯著性差別(P<0.05)，植物乳桿菌加入前后對乳液粒徑具有顯著影響(P<0.001)，有研究表明[22]，植物乳桿菌產(chǎn)生的酸具有抑菌特性，因此可用于調(diào)節(jié)胃腸道的菌群微生態(tài)平衡并促進(jìn)營養(yǎng)的消化吸收,結(jié)合圖2、圖3可以看出，加入植物乳桿菌促進(jìn)乳液中的油滴聚集和分離，加速乳液破乳,說明植物乳桿菌在人體胃腸道中具有利于消化吸收的作用。根據(jù)劉曉明[23]的研究，乳酸菌代謝產(chǎn)物包括各種氨基酸、脂肪酸、寡糖、維生素、小肽、增味劑等物質(zhì)。可能是菌生長過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物破壞了乳液的穩(wěn)定性，或菌生長加速降解蛋白質(zhì)，使乳液破乳。

圖2 O/W乳液的微觀結(jié)構(gòu)Fig.2 The microstructure of the O/W emulsion注：A1～A4和B1～B4分別表示不加菌和加菌乳液在胃消化0、180 min，小腸消化0、7 h的油滴形態(tài)

圖3 W/O乳液的微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The microstructure of the W/O emulsion注：C1～C4和D1～D4分別表示不加菌和加菌乳液在胃消化0、180 min，小腸消化0、7 h的油滴形態(tài)

a-模擬胃液；b-模擬腸液圖4 模擬腸胃消化液中乳液的粒徑變化Fig.4 The particle size change of the emulsion in the simulated gasrointesinal digestive fluid注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 乳液Zeta電位分析

圖5為O/W和W/O型大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液在消化液的作用下，對比加植物乳桿菌與不加植物乳桿菌的電位變化情況。乳液界面之間的吸引和排斥作用以及靜電作用會引起乳液發(fā)生分離和絮凝，乳液的Zeta電位絕對值越大，粒子間排斥力越大，穩(wěn)定性越強(qiáng)[24]。由圖5可知，在胃中2種大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液電位的絕對值是不斷減小的，說明乳液的穩(wěn)定性在不斷被破壞，但在小腸中電位的絕對值是不斷增大至7 h趨于穩(wěn)定，說明乳液的穩(wěn)定程度越來越高，且在小腸7 h時，電位絕對值最大，穩(wěn)定性最好。通過方差分析得知乳液是否加菌具有顯著性差異(P<0.001)。在消化的整個過程中，加菌乳液的電位普遍低于不加菌乳液的電位?？赡苁怯捎谥参锶闂U菌可以通過發(fā)酵產(chǎn)酸將乳液中的大分子蛋白質(zhì)部分降解，產(chǎn)生小分子肽和游離氨基酸,加菌乳液中作為乳化劑的蛋白質(zhì)被胃蛋白酶和乳桿菌雙重降解，乳液的穩(wěn)定性被破壞，說明乳桿菌加劇了乳液的破乳。

a-O/W型乳液；b-W/O型乳液圖5 不同類型乳液的電位變化Fig.5 The potential change of different type emulsion

2.4 乳液穩(wěn)定性分析

圖6和圖7為O/W和W/O型大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液在消化液的作用下，對比加植物乳桿菌與不加植物乳桿菌乳化穩(wěn)定性的變化情況。EAI和ESI可以表示乳液的乳化性能，乳化形成的界面蛋白膜能夠降低其表面張力，抑制乳液聚集和相互作用，EAI和ESI越大，乳液越穩(wěn)定。從圖6和圖7中可以看出，EAI和ESI趨勢基本一致，胃中乳液破乳，而在小腸中乳液的穩(wěn)定性不斷升高。利用SAS軟件分析數(shù)據(jù)，證明加菌后對乳液的穩(wěn)定性有顯著影響(P<0.001)，加菌后加速破壞了乳液的穩(wěn)定性，驗(yàn)證了乳桿菌在生長過程中需要油滴表面的蛋白，破壞了蛋白-磷脂乳液的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。

a-EAI變化；b-ESI變化圖6 模擬胃液中乳液的穩(wěn)定性變化Fig.6 The EAI and ESI change of the emulsion in the stomach

a-EAI變化；b-ESI變化圖7 模擬腸液中乳液的ESI變化Fig.7 The EAI and ESI change of the emulsion in the small intestine

3 結(jié)論

W/O和O/W型大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液中的界面蛋白在胃液中被酶解，液滴界面帶電量發(fā)生改變，分子間排斥力減小并使乳液的穩(wěn)定性變差，乳液發(fā)生了破乳現(xiàn)象；加入腸液后乳液油滴的均一程度變高，穩(wěn)定性變高。植物乳桿菌能加速蛋白質(zhì)的降解，使乳液的破乳現(xiàn)象更加嚴(yán)重，存在于人體消化體系中的植物乳桿菌可以促進(jìn)食物的分解和消化。O/W型大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液比W/O型在消化體系中更易消化，植物乳桿菌更適宜在O/W型乳液體系中生長。但對于植物乳桿菌是如何破壞大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳液的機(jī)制還不是很明確，需要對其做進(jìn)一步的研究。