那扎克提·努爾買買提，馬衣日木·賽買提，哈斯也提·依不來音

隨著社會人口老齡化進程加劇，阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）發(fā)病率日益增長，尤其在中低收入國家其增長速度更快［1］，且預計到2050年全球范圍內AD患者數(shù)量將超過1億，因此AD的早期診斷及治療一直是臨床研究熱點［2-3］。AD是一種常見的可引起老年人認知障礙的進行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，主要分為家族性AD和散發(fā)性AD兩種類型，其中散發(fā)性AD較為常見。近年來隨著分子生物學及分子遺傳學的發(fā)展，AD已成為醫(yī)學科學研究的熱點和重點，其中遺傳是AD多元病因中的重要因素之一［4］，人們通過全基因組關聯(lián)分析（genome wide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn)19號染色體上存在數(shù)個AD相關易感基因［5］，如載脂蛋白 Eε4、TOMM40、CD33、ABCA7等。因此，深入了解AD相關基因并尋找更多客觀證據(jù)對AD的臨床診斷及治療具有至關重要的作用。本研究分析了新疆地區(qū)維吾爾族與漢族AD患者19號染色體上ABCA7、TOMM40、CD33、GALP基因位 點 rs3764650、rs2075650、rs3826656、rs3865444、rs3745833多態(tài)性及民族差異，對深入研究AD的發(fā)病機制及治療措施具有重要意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年8月—2018年6月在新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院臨床神經(jīng)診療中心及烏魯木齊市六道灣醫(yī)院、昌吉市人民醫(yī)院診治的AD患者131例作為病例組，均符合《精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊》第4版（DSM-Ⅳ）中的癡呆診斷標準：文盲患者簡易精神狀態(tài)檢查量表（MMSE）評分≤17分，小學文化程度患者MMSE評分≤20分，初中及以上文化程度患者MMSE評分≤24分［6］。另選取同期新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院的體檢健康者128例作為對照組。兩組受試者性別、年齡、民族、文化程度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表1）。

1.2 納入與排除標準 納入標準：（1）年齡≥65歲；（2）在新疆地區(qū)居住時間＞10年。排除標準：（1）經(jīng)Hanchinski缺血指數(shù)量表及顱腦影像學檢查結果診斷為血管性癡呆患者；（2）因抑郁癥引起的假性癡呆患者；（3）其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、食物/藥物中毒等引起的癡呆患者；（4）合并心、血管、肺、肝、腎等重要組織/器官疾病急性期患者。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 采集兩組受試者外周靜脈血3 ml。

1.3.2 基因組DNA的提取 使用TIANamp Genomic DNA kit血液DNA提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司生產〕提取全血基因組DNA，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 基因測定 采用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增測 序 技 術 分 析 ABCA7、TOMM40、CD33、GALP基因位點多態(tài)性，單核苷酸多態(tài)性（SNP）基因信息來自美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/），根據(jù)GenBank發(fā)布的序列（代號：NM_003105）進行設計，查詢目標基因標準序列，引物序列見表2。委托博淼生物科技（北京）有限公司通過連接酶檢測-聚合酶鏈反應（LDR-PCR）方法對ABCA7、TOMM40、CD33、GALP基因的5個位點進行基因分型。

表1 兩組受試者一般資料比較Table 1 Comparison of demographic information between the two groups

表2 19號染色體代表性基因位點PCR引物序列Table 2 PCR primer sequences of representative SNPs on chromosome 19

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；采用haploview軟件計算單體型基因型頻數(shù)，Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的檢驗及計數(shù)資料、單體型基因型比較均采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 對照組與病例組 rs3764650、rs2075650、rs3826656、rs3865444、rs3745833的基因型及等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，見表3。

表3 病例組與對照組基因位點基因型及等位基因分布情況（例）Table 3 Distribution of genotype and allele of SNPs between case group and control group

2.2 基因型及等位基因頻率 對照組與病例組中漢族受 試 者 rs3764650、rs2075650、rs3826656、rs3865444基因型、等位基因頻率及rs3745833基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但rs3745833等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表4）。對照組與病例組中維吾爾族受試者rs3764650、rs2075650、rs3826656、rs3865444、rs3745833基因型、等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表5）。維吾爾族與漢族AD患者rs2075650、rs3865444、rs3745833基因型、等位基因頻率及rs3826656基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但rs3764650基因型、等位基因頻率及rs3826656等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表6）。

表4 對照組與病例組中漢族受試者基因位點基因型及等位基因頻率比較（例）Table 4 Comparison of genotype and allele frequency of SNPs in Han participants between control group and case group

表5 對照組與病例組中維吾爾族受試者基因位點基因型及等位基因頻率比較（例）Table 5 Comparison of genotype and allele frequency of SNPs in Uygur participants between control group and case group

表6 漢族與維吾爾族AD患者基因位點基因型及等位基因頻率比較（例）Table 6 Comparison of genotype and allele frequency of SNPs between Han and Uygur participants with AD

2.3 單體型構建 19號染色體上CD33基因rs3826656、rs3865444在漢族受試者、維吾爾族受試者及AD患者中均形成連鎖不平衡，見圖1（高清彩圖見本文OSID碼）。對照組與病例組中漢族、維吾爾族受試者rs3826656-rs3865444單體型GC、AA、AC基因型頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；漢族與維吾爾族AD患者rs3826656-rs3865444單體型GC、AA基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但維吾爾族AD患者rs3826656-rs3865444單體型AC基因型頻率高于漢族AD患者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表 7～9）。

3 討論

散發(fā)性AD發(fā)病年齡較晚（通常≥65歲），病因及發(fā)病機制復雜，主要包括遺傳、環(huán)境、代謝等多種因素［7］。WANG等［8］研究表明，AD相關基因顯著富集在19號染色體上，且染色體區(qū)域19p（Chrl9p）在整個AD發(fā)生、發(fā)展過程中表現(xiàn)出非常顯著的擾動。本研究旨在分析新疆地區(qū)維吾爾族與漢族AD患者19號染色體代表性基因位點多態(tài)性及民族差異。

ABCA7基因位于19q13.3，通過在細胞膜上形成一種依賴三磷腺苷（ATP）酶的通道而發(fā)揮維持細胞內外膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)的作用，主要表現(xiàn)為促進膽固醇外流和抑制β淀粉樣蛋白（Aβ）分泌。既往研究發(fā)現(xiàn)，ABCA7基因位點rs3764650多態(tài)性與AD患者老年斑負載直接相關［9］。本研究結果顯示，對照組與病例組中漢族、維吾爾族受試者rs3764650基因型及等位基因頻率間無統(tǒng)計學差異，但漢族與維吾爾族AD患者rs3764650基因型及等位基因頻率間有統(tǒng)計學差異，提示ABCA7基因可能在新疆地區(qū)維吾爾族、漢族AD患者之間存在種族特異性，究其原因可能與兩個民族人群生活習慣、民族背景等不同有關。CUKIER等［10］研究表明，非裔美國人中ABCA7等位基因形成連鎖不平衡并表現(xiàn)出種族特定的致病性改變。

圖1 CD33基因rs3826656-rs3865444單體型分布的連鎖不平衡圖Figure 1 Linkage disequilibrium diagram for haplotypes of CD33 gene rs3826656-rs3865444

表7 對照組與病例組中漢族受試者rs3826656-rs3865444單體型基因型頻率比較〔n（%）〕Table 7 Comparison of genotypic frequency of rs3826656-rs3865444 haplotypes in Han participants between control group and case group

表8 對照組與病例組中維吾爾族受試者rs3826656-rs3865444單體型基因型頻率比較〔n（%）〕Table 8 Comparison of genotypic frequency of rs3826656-rs3865444 haplotypes in Uygur participants between control group and case group

表9 漢族與維吾爾族AD患者rs3826656-rs3865444單體型基因型頻率比較〔n（%）〕Table 9 Comparison of genotypic frequency of rs3826656-rs3865444 haplotypes between Han and Uygur participants with AD

TOMM40基因位于19q13，與載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）相鄰，其中幾個SNP與ApoE基因形成連鎖不平衡［11］。TOMM40是在蛋白進入線粒體的重要入口通道形成的亞基，對蛋白質導入線粒體而言必不可少，與AD密切相關，其可變長度的多態(tài)性?？深A測遲發(fā)型AD患者的年齡［12］。MA等［13］通過分析TOMM40基因3個SNP位點（rs157580、rs2075650、rs11556505）多態(tài)性與中國北方漢族遲發(fā)型AD患者的關系發(fā)現(xiàn)，rs157580、rs2075650、rs11556505多態(tài)性可能參與中國北方漢族遲發(fā)型AD的發(fā)病過程。但本研究結果顯示，對照組與病例組中漢族、維吾爾族受試者rs2075650基因型及等位基因頻率間無統(tǒng)計學差異，漢族與維吾爾族AD患者rs2075650基因型及等位基因頻率間亦無統(tǒng)計學差異，提示新疆地區(qū)漢族及維吾爾族TOMM40基因位點rs2075650多態(tài)性與AD發(fā)病無明顯相關性。

CD33基因位于19q13.3，可編碼Siglecs，屬于Ⅰ型膜蛋白家族成員，常表達于紅細胞、免疫細胞及神經(jīng)元，其表達下調可使腦內促炎細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）水平升高并促進 AD 發(fā)?。?4］。BERTRAM 等［15］于2008年通過GWAS發(fā)現(xiàn)CD33基因位點rs3826656與AD發(fā)病相關。一篇關于高加索人群的研究發(fā)現(xiàn)，CD33基因位點rs3865444的（A）等位基因為AD的保護因素［16］。毛艷芳等［17］研究發(fā)現(xiàn)，CD33基因位點rs3826656和rs3865444的G等位基因可能是中國散發(fā)性AD的風險等位基因。本研究結果顯示，病例組中漢族、維吾爾族受試者CD33基因rs3826656、rs3865444基因型及等位基因頻率間無統(tǒng)計學差異，漢族與維吾爾族AD患者rs3826656基因型頻率及rs3865444基因型、等位基因頻率間無統(tǒng)計學差異，但漢族與維吾爾族AD患者rs3826656等位基因頻率間有統(tǒng)計學差異；進一步研究還發(fā)現(xiàn)，rs3826656-rs3865444存在較高連鎖不平衡，提示新疆地區(qū)漢族與維吾爾族CD33基因位點rs3826656多態(tài)性存在差異，但需進一步完善維吾爾族與對照組健康體檢者間的研究以排除種族帶來的偏差。

目前，國內外有關GALP基因的研究甚少。GALP是一種參與機體能量代謝的神經(jīng)肽，其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，可參與學習和記憶、神經(jīng)損傷修復和保護等多種生理過程，進而可能在AD、癲癇、神經(jīng)性疼痛、抑郁癥等多種疾病的病理過程中發(fā)揮潛在作用［18］。本研究結果顯示，對照組與病例組中維吾爾族受試者及漢族與維吾爾族AD患者GALP基因位點rs3745833基因型、等位基因頻率間無統(tǒng)計學差異，對照組與病例組中漢族受試者rs3745833基因型頻率間無統(tǒng)計學差異，但rs3745833的G/C等位基因頻率間有統(tǒng)計學差異，提示GALP基因位點rs3745833多態(tài)性可能與新疆地區(qū)漢族人群AD發(fā)病有關。

綜上所述，GALP基因位點rs3745833多態(tài)性可能與新疆地區(qū)漢族人群AD發(fā)病有關，ABCA7基因位點rs2075650、CD33基因位點rs3826656多態(tài)性在新疆地區(qū)維吾爾族與漢族AD患者中存在差異。但本研究納入樣本量較小，患者來源局限，不能很好地代表新疆地區(qū)，因此民族間的基因差異仍有待大樣本量研究進一步證實。

志謝：感謝烏魯木齊市六道灣醫(yī)院、昌吉市人民醫(yī)院在本研究病例收集過程中給予的大力支持與幫助。

作者貢獻：那扎克提·努爾買買提、哈斯也提·依不來音進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析；那扎克提·努爾買買提進行結果分析與解釋，并負責撰寫論文；那扎克提·努爾買買提、馬衣日木·賽買提進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析及論文的修訂；哈斯也提·依不來音負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。