李瑞玲，羅倚坪，劉曉風(fēng)，孫 勇,，李 東,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，黑龍江省寒地農(nóng)業(yè)可再生資源利用技術(shù)及裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，環(huán)境與應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境微生物四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

琥珀酸是一種重要的四碳二元羧酸，在2004年，它被美國(guó)能源部列為12 種最有潛力的大宗生物基化學(xué)品之首。琥珀酸是一種新型、靈活性高、環(huán)境友好的生物基平臺(tái)化合物，可作為生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的原料，如四氫呋喃、己二酸、γ-丁內(nèi)酯和1,4-丁二醇等。因而它在食品、農(nóng)業(yè)和制藥等許多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[1-3]。

在食品領(lǐng)域，琥珀酸是影響啤酒口味的重要有機(jī)酸，還可用作奶類制品的鐵強(qiáng)化劑以及新型乳化劑，琥珀酸還可作為食品的鮮味劑和酸味劑等[4-5]。目前，琥珀酸的制備方法主要為化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法[6-7]。由于化學(xué)法制備過(guò)程復(fù)雜、分離成本高、污染環(huán)境，且價(jià)格十分昂貴，故此法限制了琥珀酸的擴(kuò)大應(yīng)用[8]。微生物發(fā)酵法利用可再生資源，生產(chǎn)成本低廉，發(fā)酵過(guò)程對(duì)環(huán)境無(wú)污染且能固定二氧化碳，為解決溫室氣體開辟了新途徑[9-11]。因此利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的生物技術(shù)路線替代化學(xué)路線具有更長(zhǎng)遠(yuǎn)的意義[12-13]。

琥珀酸是厭氧或兼性厭氧微生物通過(guò)厭氧發(fā)酵獲得的最終產(chǎn)物之一[14]。目前，關(guān)于產(chǎn)琥珀酸微生物菌株研究較多的有產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniproducens）、產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）、產(chǎn)琥珀酸曼海姆氏菌（Mannheimia succiniciproducens）和大腸桿菌（Escherichia coli）[9-11]。大腸桿菌由于其遺傳背景簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速率快、易培養(yǎng)等諸多優(yōu)點(diǎn)而受到越來(lái)越多的重視，被認(rèn)為是最有潛力的琥珀酸生產(chǎn)菌株[15-16]。Clark[17]以野生型大腸桿菌W1485為出發(fā)菌株，利用葡萄糖進(jìn)行厭氧發(fā)酵，所得琥珀酸產(chǎn)率為（琥珀酸與葡萄糖物質(zhì)的量比）0.15～0.2 mol/mol。Millard等[18]以葡萄糖作為碳源，利用野生型大腸桿菌JCL1208發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，所得琥珀酸產(chǎn)量為3.0 g/L。

本研究以牛瘤胃內(nèi)容物作為菌源，用富馬酸鈉為碳源，在高濃度二氧化碳?xì)夥障赂患Y選獲得產(chǎn)琥珀酸菌株，以期實(shí)現(xiàn)葡萄糖和木糖高效轉(zhuǎn)化制備琥珀酸的目的。目前已報(bào)道的菌株多以葡萄糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸，但很少有菌株利用木糖為碳源，或既可利用葡萄糖也可利用木糖為碳源厭氧發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸[19-20]，研究旨在為木質(zhì)纖維生物質(zhì)原料（水解后同時(shí)含有葡萄糖和木糖）生產(chǎn)琥珀酸提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

樣品取于四川省成都市雙流區(qū)現(xiàn)場(chǎng)屠宰的牛瘤胃內(nèi)容物。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基[21]：玉米漿10 g，富馬酸鈉15 g，K2HPO43 g，堿式碳酸鎂1.5 g，NaCl 1.0 g，(NH4)2SO41.0 g，CaCl20.2 g，MgCl20.2 g，另外添加莫能菌素干粉劑0.2 g，去離子水1 000 mL。

篩選培養(yǎng)基[21]：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，葡萄糖5 g，酵母提取物5 g，溴甲酚綠0.1 g，瓊脂18 g，pH 6.5，去離子水1 000 mL。

活化培養(yǎng)基TSB[22]：葡萄糖2.5 g，胰蛋白胨17 g，大豆蛋白胨3 g，NaCl 5 g，K2HPO42.5 g，pH 7.3±0.2，去離子水1 000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基[22]：葡萄糖/木糖30 g，酵母提取物5 g，NaH2PO41.16 g，Na2HPO40.31 g，NaCl 1 g，CaCl20.2 g，MgCl20.2 g，堿式碳酸鎂30 g，VB121 μg，生物素20 μg，葉酸20 μg，硫胺素50 μg，核黃素50 μg，煙酸50 μg，泛酸50 μg，對(duì)氨基苯甲酸50 μg，硫辛酸50 μg，VB6100 μg，硅酮消泡劑1 mL，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

實(shí)驗(yàn)中所用培養(yǎng)基均在115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑

琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；糖標(biāo)準(zhǔn)品 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

E500厭氧工作站、Anaerobox IV厭氧培養(yǎng)箱 美國(guó)Gene Science公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；TU-1810SPC紫外分光光度計(jì) 北京普析通用公司；Pro臺(tái)式掃描電子顯微鏡 荷蘭Phenom公司；S1000雙槽梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 分析測(cè)定方法

有機(jī)酸測(cè)定：高效液相色譜法，自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱為Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm），流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4溶液，pH 2.5，柱溫50 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速0.6 mL/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)210 nm。

殘?zhí)菧y(cè)定：高效液相色譜法，示差檢測(cè)器，柱溫50 ℃（色譜柱與色譜條件與有機(jī)酸測(cè)定相同，采用紫外與示差檢測(cè)器聯(lián)用檢測(cè)模式）。

生物量測(cè)定[22]：將發(fā)酵液用7% HCl溶液稀釋，使A660nm值在0.2～0.8之間，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定。生物量（OD660nm）=A660nm×稀釋倍數(shù)。

1.3.2 菌株鑒定

形態(tài)特征和生理生化特征測(cè)定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[23]。利用試劑盒提取菌體總DNA，以菌體總DNA為模板，采用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物交至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序所得基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，用BLAST進(jìn)行序列對(duì)比分析。利用MEGA 6.0軟件選取同源性高的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)分析，用鄰近法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.3.3 產(chǎn)琥珀酸菌的富集

在厭氧工作站中將瘤胃液經(jīng)4 層紗布過(guò)濾，600 r/min離心10 min，去掉飼料顆粒及纖毛蟲，留上清液，8 000 r/min離心15 min，棄上清液，用生理鹽水溶解沉淀。以10%接種量接入裝有100 mL富集培養(yǎng)基的250 mL厭氧瓶中，37 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔24 h轉(zhuǎn)接一次，連續(xù)轉(zhuǎn)接3 次。

1.3.4 產(chǎn)琥珀酸菌的篩選

將最后一次所得的富集培養(yǎng)液按十倍稀釋法稀釋10－5、10－6、10－7、10－8四個(gè)稀釋度，各取0.1 mL涂布到篩選培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～36 h。觀察菌落周圍溴甲酚綠的變色情況，確定該菌株有無(wú)產(chǎn)酸能力，挑取黃色變色圈中央的典型單菌落，純化多次至純菌株。

將純種分離得到的菌株活化24 h后，以10%的接種量接入裝有45 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL厭氧瓶中，在100% CO2、37 ℃、150 r/min條件下厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，10 000 r/min離心10 min，0.22 μm濾膜過(guò)濾，采用高效液相色譜測(cè)定每個(gè)樣品中琥珀酸的產(chǎn)量，選取琥珀酸產(chǎn)量較高菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 菌種發(fā)酵條件

將體積分?jǐn)?shù)10%的種子液接種至裝有45 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL厭氧瓶中，分別以初始糖質(zhì)量濃度為30 g/L的葡萄糖和木糖為碳源，在37 ℃條件下，通入CO2進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，葡萄糖發(fā)酵24 h，木糖發(fā)酵66 h。對(duì)菌體OD660nm、糖消耗、琥珀酸積累進(jìn)行分析。

1.3.6 琥珀酸產(chǎn)率（還原糖對(duì)琥珀酸的轉(zhuǎn)化率）的計(jì)算

式中：γ1為初始還原糖質(zhì)量濃度/（g/L）；γ2為琥珀酸質(zhì)量濃度/（g/L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 琥珀酸產(chǎn)生菌篩選

表1 葡萄糖碳源發(fā)酵所篩選菌株產(chǎn)琥珀酸質(zhì)量濃度Table 1 oncentrations of succinic acid produced by 66 isolates using glucose as carbon source

表2 木糖碳源發(fā)酵所篩選菌株產(chǎn)琥珀酸質(zhì)量濃度Table 2 Concentrations of succinic acid produced by 66 isolates using xylose as carbon source

22 IS-5 2.89 44 RM-2 4.09 66 N-4 0.87

經(jīng)過(guò)對(duì)瘤胃內(nèi)容物大量菌株的篩選分離獲得產(chǎn)酸菌株66 株。分別以葡萄糖和木糖為碳源進(jìn)行琥珀酸發(fā)酵，其中菌株LW-2利用葡萄糖和木糖產(chǎn)琥珀酸質(zhì)量濃度最高，分別為4.48 g/L和5.27 g/L（表1、2），表明該菌株具有較好利用葡萄糖和木糖發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的能力。因此，選取菌株LW-2進(jìn)行下一步形態(tài)、生理生化鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2 菌種鑒定

圖1 菌株LW-2掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrographs of strain LW-2

表3 菌株LW-2生理生化鑒定結(jié)果Table 3Physiological and biochemical identification of strain LW-2

圖2 菌株LW-2的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain LW-2

菌株LW-2菌落呈圓形、微凸、無(wú)色、邊緣規(guī)則整齊、半透明、表面光滑濕潤(rùn)。掃描電鏡觀測(cè)菌體呈短直桿狀、不產(chǎn)芽孢、菌體大小為0.53～0.61 μm×0.96～1.71 μm（圖1）；該菌有莢膜、有鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、革蘭氏陰性，在好氧和厭氧條件下均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，其他生理生化特征見(jiàn)表3。測(cè)序結(jié)果顯示菌株LW-2的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度為1 479 bp，在BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比對(duì)，并使用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），菌株LW-2與腸桿菌科弗格森埃希菌（Escherichia fergusonii）的相似性達(dá)99.98%，并且在系統(tǒng)發(fā)育樹上親緣關(guān)系最近。根據(jù)菌株LW-2的形態(tài)特征、生理生化特征以及其16S rDNA序列分析，鑒定菌株LW-2為弗格森埃希菌。

2.3 以葡萄糖和木糖分別為碳源的發(fā)酵

微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能，還要賦以合適的環(huán)境條件，如培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、接種量等[24]。分別以葡萄糖和木糖為碳源，按照1.1.2節(jié)的發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)菌株LW-2的發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、pH值調(diào)節(jié)劑及其用量等進(jìn)行單因素優(yōu)化，增加菌體細(xì)胞密度，提高琥珀酸的產(chǎn)量，為進(jìn)一步利用該菌株奠定基礎(chǔ)。

2.3.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵琥珀酸產(chǎn)量的影響

以葡萄糖為碳源（圖3A），OD660nm在12 h達(dá)到最高值5.15，琥珀酸最終產(chǎn)量在24 h達(dá)到最高值為4.71 g/L，琥珀酸產(chǎn)率為15.70%。Millard等[18]以葡萄糖為碳源利用野生型大腸桿菌JCL1208發(fā)酵獲得的琥珀酸產(chǎn)量為3.27 g/L；Goldberg等[25]以葡萄糖為碳源利用大腸桿菌CA79發(fā)酵得到的琥珀酸產(chǎn)率僅為9.0%。與其結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)所用菌株LW-2以葡萄糖為碳源發(fā)酵獲得的琥珀酸產(chǎn)量為大腸桿菌JCL1208的1.44 倍，獲得的琥珀酸產(chǎn)率為大腸桿菌CA79的1.74 倍。以木糖為碳源（圖3B），OD660nm在24 h達(dá)到最高值4.85，琥珀酸最終產(chǎn)量在66 h達(dá)到最高值為6.21 g/L，琥珀酸產(chǎn)率為20.70%。Liu Rongming等[26]以木糖為碳源，利用野生型大腸桿菌K12厭氧發(fā)酵48 h，琥珀酸產(chǎn)量?jī)H為（0.87±0.12）g/L，琥珀酸產(chǎn)率僅為0.14%。因此，本實(shí)驗(yàn)所用野生型菌株LW-2具有更好的利用木糖發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸能力。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)OD660 nm和琥珀酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on OD660 nm and succinic acid production

2.3.2 溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵琥珀酸產(chǎn)量的影響

琥珀酸發(fā)酵時(shí)需要通入CO2，溫度既影響CO2的溶解度，又影響菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的合成。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，琥珀酸發(fā)酵的溫度一般在37 ℃左右[27-29]。以葡萄糖為碳源（圖4A），當(dāng)培養(yǎng)溫度為40 ℃，發(fā)酵24 h，菌體生物量最高，琥珀酸產(chǎn)量也達(dá)到最高為5.44 g/L，琥珀酸產(chǎn)率為18.13%，該最適溫度與瘤胃相似39～41 ℃。Wang Dan等[30]以葡萄糖為碳源利用野生型大腸桿菌發(fā)酵獲得的琥珀酸產(chǎn)率為4%。與該結(jié)果相比，菌株LW-2以葡萄糖為碳源發(fā)酵獲得的琥珀酸產(chǎn)率是其4.5 倍。以木糖為碳源（圖4B），當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃，發(fā)酵66 h，此時(shí)菌體生物量值最大，琥珀酸產(chǎn)量也達(dá)到最高為6.21 g/L，琥珀酸產(chǎn)率為20.70%。唐緒位等[31]以木糖為碳源，在37 ℃條件下利用野生型大腸桿菌MG1655發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，所得琥珀酸產(chǎn)量為4.92 g/L。與其結(jié)果相比，菌株LW-2在37 ℃條件下以木糖為碳源發(fā)酵獲得的琥珀酸產(chǎn)量提高了21%。

圖4 溫度對(duì)OD660 nm及發(fā)酵琥珀酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on OD660 nm and succinic acid production

2.3.3 接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵琥珀酸產(chǎn)量的影響

接種量過(guò)大會(huì)影響產(chǎn)物合成，而且會(huì)過(guò)多移入代謝廢物，經(jīng)濟(jì)性差；過(guò)小會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，降低發(fā)酵效率。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[29,32]，琥珀酸發(fā)酵的接種量大多在5%～10%之間。本實(shí)驗(yàn)不同接種量對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響見(jiàn)圖5。

以葡萄糖為碳源（圖5A），當(dāng)接種量為1%～2.5%時(shí)，琥珀酸產(chǎn)量和菌體生物量緩慢增加；當(dāng)接種量超過(guò)2.5%時(shí)，琥珀酸產(chǎn)量未呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。該結(jié)果說(shuō)明葡萄糖主要被用于大量菌體的自身生長(zhǎng)代謝，而對(duì)琥珀酸的積累不益；當(dāng)接種量為2.5%時(shí)，發(fā)酵24 h，OD660nm及琥珀酸產(chǎn)量最高分別為4.05和6.36 g/L，琥珀酸產(chǎn)率為21.2%。李宜奎等[33]利用大腸桿菌突變株QQS101以葡萄糖為碳源，1%的接種量厭氧發(fā)酵，積累琥珀酸0.951 g/L；于麗等[34]利用大腸桿菌JM001以葡萄糖為碳源，10%的接種量厭氧發(fā)酵，琥珀酸產(chǎn)率為14.4%。與其結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)雖然利用菌株LW-2以2.5%的接種量厭氧發(fā)酵，但是獲得的琥珀酸產(chǎn)量卻是大腸桿菌突變株QQS101的6.69 倍，獲得的琥珀酸產(chǎn)率是大腸桿菌JM001的1.47 倍。

圖5 接種量對(duì)OD660 nm及發(fā)酵琥珀酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of inoculum amount on OD660 nm and succinic acid production

以木糖為碳源（圖5B），接種量低于7.5%時(shí)，發(fā)酵液發(fā)酵不充分，產(chǎn)琥珀酸量較低。隨著接種量的增加，琥珀酸產(chǎn)生量逐漸增多。當(dāng)發(fā)酵接種量高于7.5%時(shí)，隨著接種量的加大，菌體生物量緩慢增加并趨于平穩(wěn)，說(shuō)明菌體此時(shí)已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體生物量幾乎不變，而琥珀酸產(chǎn)量呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)，表明此時(shí)發(fā)酵液中的木糖多消耗在菌體細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖上，使琥珀酸產(chǎn)量減少。當(dāng)發(fā)酵接種量為7.5%時(shí)，發(fā)酵66 h，琥珀酸產(chǎn)量最高可達(dá)7.51 g/L，琥珀酸產(chǎn)率為25.03%。萬(wàn)青等[35]采用常壓室溫等離子體射流誘變產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌菌株，在厭氧條件下，利用以木糖為碳源的培養(yǎng)基，篩選得到1 株可以代謝木糖并積累琥珀酸的突變株DA111，該突變菌株利用木糖以10%的接種量發(fā)酵72 h可以產(chǎn)生1.02 g/L的琥珀酸，琥珀酸產(chǎn)率為24.38%。與該結(jié)果相比，當(dāng)使用7.5%的接種量時(shí)，本實(shí)驗(yàn)可獲得更高產(chǎn)量、更高產(chǎn)率的琥珀酸。

2.3.4 培養(yǎng)基中pH值調(diào)節(jié)劑對(duì)菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵琥珀酸產(chǎn)量的影響

供給二氧化碳或一些碳酸鹽類化合物可獲得高產(chǎn)量琥珀酸鹽。當(dāng)二氧化碳或碳酸鹽溶于水與水反應(yīng)時(shí)，生成之間的平衡由培養(yǎng)基pH值決定。隨著菌體發(fā)酵產(chǎn)酸的進(jìn)行，發(fā)酵液的pH值逐漸降低，為了維持菌體最適的發(fā)酵條件，需要加入調(diào)節(jié)劑[36]。不同的pH值調(diào)節(jié)劑溶于水時(shí)有不同的特性，不同調(diào)節(jié)劑對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響見(jiàn)圖6。

圖6 pH值調(diào)節(jié)劑對(duì)OD660 nm及發(fā)酵琥珀酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of pH regulators on OD660 nm and succinic acid production

分別以葡萄糖和木糖為碳源時(shí)，4 種調(diào)節(jié)劑MgCO3、CaCO3、Na2CO3、NaHCO3對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響相似。當(dāng)Na2CO3和NaHCO3作為pH值調(diào)節(jié)劑時(shí)，琥珀酸產(chǎn)量和菌體生物量均較低；當(dāng)CaCO3作為pH值調(diào)節(jié)劑時(shí)，菌體生長(zhǎng)較好，但琥珀酸產(chǎn)量較低。而當(dāng)以MgCO3作為pH值調(diào)節(jié)劑時(shí)琥珀酸產(chǎn)量最高，分別為6.36 g/L和7.51 g/L；琥珀酸產(chǎn)率分別為21.20%和25.03%。但是菌體生物量不及CaCO3作為pH值調(diào)節(jié)劑時(shí)高。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[37]，加入CaCO3可以中和發(fā)酵產(chǎn)生的酸，但是CaCO3會(huì)抑制產(chǎn)酸微生物產(chǎn)琥珀酸。加入Na2CO3和NaHCO3中和有機(jī)酸，由于Na2CO3和NaHCO3溶在發(fā)酵液中會(huì)使發(fā)酵液的pH值維持在8～10左右，而且過(guò)量的Na＋也不利于產(chǎn)琥珀酸菌的生長(zhǎng)。加入MgCO3中和發(fā)酵所產(chǎn)生的有機(jī)酸，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程菌體代謝旺盛，發(fā)酵效果較佳[29]。本實(shí)驗(yàn)不同pH值調(diào)節(jié)劑在琥珀酸發(fā)酵過(guò)程中的作用與文獻(xiàn)報(bào)道的相似，且反應(yīng)過(guò)程中MgCO3可以釋放出CO2，維持琥珀酸發(fā)酵所需的CO2環(huán)境。另外，Mg2＋在維持細(xì)胞新陳代謝方面起重要作用，且Mg2＋是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的一種輔助因子，對(duì)代謝流的分布起著關(guān)鍵的作用。因此，當(dāng)分別以葡萄糖和木糖作為碳源發(fā)酵時(shí)，均選定MgCO3作為發(fā)酵過(guò)程的pH值調(diào)節(jié)劑。

2.3.5 培養(yǎng)基中MgCO3用量對(duì)菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵琥珀酸產(chǎn)量的影響

在琥珀酸發(fā)酵過(guò)程中，有機(jī)酸的積累會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中pH值下降，因此維持發(fā)酵體系內(nèi)pH值的穩(wěn)定至關(guān)重要。不同質(zhì)量濃度MgCO3對(duì)琥珀酸發(fā)酵的影響見(jiàn)圖7。不管是以葡萄糖還是木糖為碳源，均為MgCO3用量為30 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)最好，琥珀酸產(chǎn)量最高，分別為6.36 g/L和7.51 g/L，琥珀酸產(chǎn)率分別為21.20%和25.03%。MgCO3用量可能影響代謝流分布。當(dāng)MgCO3用量低于30 g/L時(shí)，隨著MgCO3用量的增加，流向琥珀酸的代謝流增加。但是當(dāng)MgCO3用量高于30 g/L時(shí)，過(guò)量的MgCO3對(duì)菌體造成抑制。MgCO3不僅是琥珀酸的合成來(lái)源，也是影響厭氧代謝流向的重要因素。Hyohak等[29]研究結(jié)果表明，適量增加pH值調(diào)節(jié)劑碳酸氫鹽的用量可提高CO2溶解濃度，過(guò)量添加對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有負(fù)面影響，進(jìn)而影響琥珀酸產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Hyohak等[29]獲得的結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本研究篩選獲得1 株尚未被報(bào)道的產(chǎn)琥珀酸菌——弗格森埃希菌，且利用木糖發(fā)酵獲得的琥珀酸產(chǎn)量高于葡萄糖。該菌株利用葡萄糖產(chǎn)琥珀酸的最佳工藝條件為發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度40 ℃、接種量2.5%、pH值調(diào)節(jié)劑MgCO3、MgCO3用量30 g/L，在該條件下所得琥珀酸產(chǎn)量為6.36 g/L，比優(yōu)化前提高了41.96%；利用木糖產(chǎn)琥珀酸的最佳工藝條件為發(fā)酵時(shí)間66 h、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量7.5%、pH值調(diào)節(jié)劑MgCO3、MgCO3用量30 g/L，在該條件下所得琥珀酸產(chǎn)量為7.51 g/L，比優(yōu)化前提高了42.50%。研究為進(jìn)一步利用該菌株以木質(zhì)纖維生物質(zhì)原料（水解后主要含有葡萄糖和木糖）生產(chǎn)琥珀酸提供參考。