李志如，韓建春,,，劉容旭，劉丹怡，梁君鋒

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028）

細(xì)菌素是一種小分子質(zhì)量生物活性抗菌肽，在許多細(xì)菌的核糖體中合成并在細(xì)胞外釋放。細(xì)菌素能夠殺死或抑制原核生物的生長(zhǎng)，有助于抵抗病原體和一些具有抗生素抗性的細(xì)菌菌株[1]。細(xì)菌素與合成藥物和化學(xué)防腐劑不同，即使在低劑量下，細(xì)菌素仍然具有快速和強(qiáng)效的作用[2]，并且不會(huì)顯著改變?nèi)梭w腸道的微生物群[3-4]。其新的作用模式和對(duì)一些致病性細(xì)菌具有抑制作用，使其在食品防腐和保鮮方面?zhèn)涫荜P(guān)注[5-6]。其中乳酸菌細(xì)菌素通常被認(rèn)為是安全的[7]，目前產(chǎn)細(xì)菌素戊糖乳桿菌已有許多文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]。其中Okkers[11]對(duì)Pentocin TV35b進(jìn)行純化；呂燕妮[12]對(duì)Pentocin 31-1分離純化。戊糖乳桿菌素多具耐熱性高、分子質(zhì)量小、在酸性或弱堿性條件下穩(wěn)定的特點(diǎn)[13]，具有廣泛的抑菌譜并且對(duì)一些食品致病菌具有較強(qiáng)的抑制作用[14]，對(duì)于食品和制藥工業(yè)都具有重要意義。

本研究主要對(duì)從酸菜水中得到的乳酸菌進(jìn)行16S rDNA鑒定并測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，然后從其發(fā)酵液中分離純化細(xì)菌素，測(cè)定其分子質(zhì)量。同時(shí)研究溫度、pH值、酶和化學(xué)試劑對(duì)該細(xì)菌素抑菌效果的影響。目的是研究細(xì)菌素的有效分離和純化方法以及生物學(xué)特性，為其進(jìn)一步研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）LS1分離自酸菜水；指示菌單核細(xì)胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）CMCC54004和大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922均保藏于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院教育部乳品科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品、H2O2酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K 美國(guó)Sigma公司；醋酸鈉、冰乙酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純；乙腈、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）和甲醇均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

SP Sepharose Fast Flow填料、Superdex 30 Increase層析柱、GE AKTA pure 150蛋白純化液相色譜系統(tǒng) 瑞典GE Healthcare公司；3-30KS高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；Pilot5-8ES真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Ultimate3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 德國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 戊糖乳桿菌LS1生長(zhǎng)與拮抗活性曲線

將活化后的戊糖乳桿菌LS1接種到MRS液體培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（108CFU/mL）。接種3%種子液于250 mL MRS培養(yǎng)基，每2 h（0～48 h）取發(fā)酵液5 mL。稀釋后，用MRS培養(yǎng)基作空白對(duì)照，測(cè)定OD600nm值；每6 h（0～48 h）取發(fā)酵液5 mL測(cè)定pH值，8 000 r/min離心15 min取上清液，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測(cè)定抑菌活性，以單核細(xì)胞性李斯特菌CMCC 54004為指示菌。

1.3.2 產(chǎn)細(xì)菌素菌株鑒定

采用16S rDNA鑒定，參照J(rèn)ang等[15]方法，離心收集菌體后，用DNA提取試劑盒，提取出菌株DNA，引物為27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’），送于吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。

1.3.3 發(fā)酵上清液制備

將5%的戊糖乳桿菌LS1（18 h細(xì)胞年齡）培養(yǎng)物接種到MRS肉湯上，37 ℃培養(yǎng)42 h，8 000 r/min離心15 min后，通過(guò)0.22 μm膜過(guò)濾得到上清液與菌體，取上清液用3.0 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)至6.5，凍干備用。

1.3.4 細(xì)菌素分離純化

1.3.4.1 硫酸銨粗提細(xì)菌素

取15 g凍干樣品溶于1 000 mL去離子水，用20%、40%、60%、80%飽和度的硫酸銨，在轉(zhuǎn)速120 r/min條件下攪拌24 h，然后10 000 r/min、4 ℃離心20 min，通過(guò)0.22 μm孔徑的硝酸纖維素膜過(guò)濾分別得到上清液與沉淀，以單核細(xì)胞性李斯特菌CMCC54004和大腸桿菌ATCC25922為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法分別測(cè)定沉淀復(fù)溶液與上清液的抑菌圈直徑，并以沒(méi)有接菌的培養(yǎng)基經(jīng)硫酸銨沉淀后的沉淀復(fù)溶液作空白對(duì)照，選取硫酸銨溶液的最佳飽和度。

1.3.4.2 Sephadex G-10柱色譜脫鹽及純化

將60%飽和度硫酸銨進(jìn)行沉淀，離心過(guò)濾后的上清液通過(guò)Sephadex G-10柱色譜系統(tǒng)脫鹽并純化，以超純水為緩沖液，流速為6 mL/min，然后通過(guò)280 nm波長(zhǎng)檢測(cè)細(xì)菌素，采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測(cè)定其抑菌活性。

1.3.4.3 SP Sepharose Fast Flow純化

參照Tahiri等[16]方法并稍作修改，將從Sephadex G-10柱色譜系統(tǒng)純化獲得初步純化細(xì)菌素通過(guò)20 mmol/L醋酸鹽沖液（pH 3.8）平衡的SP-Sepherose Fast Flow進(jìn)行純化。用NaCl梯度（0～0.5 mol/L）線性洗脫細(xì)菌素，流速為5 mL/min。然后通過(guò)280 nm波長(zhǎng)紫外檢測(cè)細(xì)菌素，并測(cè)定其抑菌活性。然后合并活性級(jí)分，用Sephadex G-10柱色譜系統(tǒng)脫鹽后，真空冷凍干燥。

1.3.4.4 Superdex 30 Increase分離純化細(xì)菌素

參照劉輝[17]方法并稍作修改，用5 mL醋酸鹽緩沖液溶解凍干樣品，使用Superdex 30 Increase，平衡2 個(gè)柱體積，在pH 5.2條件下洗脫，洗脫體積為1.5 CV，通過(guò)紫外280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)菌素，流速1 mL/min，每6 mL為一管進(jìn)行收集，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測(cè)定其抑菌活性。

1.3.5 細(xì)菌素純度的檢測(cè)

參照Ullah等[18]并稍作修改，取純化后獲得的活性峰樣品，使用HPLC測(cè)其純度。平衡液A：超純水＋0.1% TFA；洗脫液B：純乙腈＋0.1% TFA；上樣量為20 μL，以1.0 mL/min的流速，洗脫程序?yàn)?～5 min，95% A，5% B；5～20 min，95%～0% A，5%～100% B。采用Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），在215 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外檢測(cè)。

1.3.6 質(zhì)譜分析

參照劉輝[17]方法并稍作修改，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定從Superdex 30 Increase分離純化得到的細(xì)菌素Pentocin LS1分子質(zhì)量。上樣為20 μL，洗脫條件為5%～90%乙腈溶液，洗脫時(shí)間60 min，總離子流圖m/z340～2 000，通過(guò)數(shù)據(jù)依賴采集模式收集數(shù)據(jù)。二級(jí)質(zhì)譜是采用誘導(dǎo)碰撞解離（collision-induced dissociation，CID）方式捕捉二級(jí)質(zhì)譜中的b和y離子，通過(guò)Peaks 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析[19]。

1.3.7 抑菌譜

將所有指示菌在37 ℃培養(yǎng)24 h后，稀釋至106CFU/mL，制備涂布有不同細(xì)菌的指示平板。在不同指示平板上通過(guò)牛津杯擴(kuò)散法檢測(cè)發(fā)酵上清液樣品對(duì)不同指示菌是否產(chǎn)生抑菌圈，并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.8 細(xì)菌素穩(wěn)定性分析

按照Ge Jingping等[20]方法進(jìn)行細(xì)菌素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。將細(xì)菌素置于40、60、80 ℃持續(xù)30 min以及100、121 ℃持續(xù)15 min，在將樣品冷卻至室溫后測(cè)試抑制活性。通過(guò)添加不同的酶測(cè)試細(xì)菌素對(duì)酶的敏感性，即蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、透明質(zhì)酸酶、過(guò)氧化氫酶，使最終酶質(zhì)量濃度為1 mg/mL，然后在37 ℃將該溶液溫育1 h后，測(cè)試抑制活性。將細(xì)菌素調(diào)節(jié)至各種pH值（2、3、5、8和10），然后在室溫下溫育2 h，測(cè)試抑制活性。接觸不同化學(xué)品時(shí)細(xì)菌素的穩(wěn)定性，即1%（V/V）吐溫80、1%（V/V）Triton X-100、1 mg/mL十二烷基硫酸鈉，通過(guò)將這些化學(xué)物質(zhì)添加到細(xì)菌素中然后在室溫下孵育2 h然后測(cè)定抑制活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 戊糖乳桿菌LS1生長(zhǎng)與拮抗活性曲線

圖1 LS1菌株的生長(zhǎng)及拮抗活性曲線Fig.1 Growth rate and antagonistic activity curves of strain LS1

將戊糖乳桿菌LS1在37 ℃條件下培養(yǎng)，其生長(zhǎng)曲線見圖1。在培養(yǎng)2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體數(shù)量迅速增加，在22 h達(dá)到峰值，然后逐漸平緩，到達(dá)穩(wěn)定期；pH值從第6小時(shí)開始快速下降，24 h后逐漸穩(wěn)定至3.7左右；培養(yǎng)18 h后出現(xiàn)明顯抑菌圈，在第42小時(shí)抑菌直徑達(dá)到峰值為20.51 mm，隨后趨于平緩，說(shuō)明抑菌活性物質(zhì)主要在發(fā)酵后期產(chǎn)生。

2.2 乳酸菌菌種的鑒定

以2%瓊脂糖凝膠對(duì)提取菌株DNA后擴(kuò)增片段進(jìn)行電泳，得到約1 500 bp的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）片段，結(jié)果見圖2。

圖2 LS1菌株的16S rDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis patterns of PCR-amplified fragments from LS1 strain

將PCR的產(chǎn)物在吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序的結(jié)果輸入到www.NCBI.nlm.nih.gov，進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，得到菌株的相似度。根據(jù)同源性分析發(fā)現(xiàn)LS1屬于戊糖乳桿菌，相似度達(dá)到99%，采用MEGA 7.0軟件，鄰接算法構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 LS1菌株的16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain LS1 based on the 16S rDNA gene sequence

2.3 細(xì)菌素的分離純化

2.3.1 硫酸銨粗提細(xì)菌素

由表1可知，分別用飽和度為20%、40%、60%硫酸銨，得到的沉淀量隨硫酸銨飽和度增加而增加，但均沒(méi)有明顯抑菌圈，上清液中出現(xiàn)較大抑菌圈并且差異不顯著；在硫酸銨飽和度為60%時(shí)，對(duì)大腸桿菌抑菌直徑為17.60 mm，對(duì)單核細(xì)胞性李斯特抑菌直徑為20.15 mm。當(dāng)硫酸銨飽和度增加到80%時(shí)，沉淀中出現(xiàn)抑菌圈，相應(yīng)地在上清液中抑菌圈減小。說(shuō)明在硫酸銨飽和度達(dá)到80%以后發(fā)酵上清液中的細(xì)菌素就會(huì)被逐漸沉淀出來(lái)。故選擇60%硫酸銨既能夠保證將細(xì)菌素留在上清液中又能夠最大程度地將雜蛋白沉淀除去。

表1 不同飽和度的硫酸銨沉淀細(xì)菌素結(jié)果Table 1 Results of bacteriocin precipitation using different degrees of ammonium sulfate saturation

2.3.2 Sephadex G-10柱色譜脫鹽并純化

圖4 Pentocin LS1的Sephadex G-10層析圖譜Fig.4 Ion-exchange chromatogram of pentocin LS1 on Sephadex G-10

由于60%硫酸銨沉淀除雜上清液中含有大量鹽，選用Sephadex G-10柱色譜進(jìn)行脫鹽。得到P1、P2兩個(gè)較大的紫外峰（圖4），P2無(wú)明顯抑菌圈而且與鹽峰重合；P1峰形較好，能夠較好地與分子質(zhì)量較小雜蛋白分開，對(duì)大腸桿菌和單核細(xì)胞性李斯特菌抑菌活性分別為25.62 mm和17.88 mm；故選擇峰P1進(jìn)行下一步純化。

2.3.3 SP Sepharose Fast Flow純化抗菌肽

圖5 Pentocin LS1的SP Sepharose Fast Flow層析圖譜Fig.5 Ion-exchange chromatogram of pentocin LS1 on SP Sepharose Fast Flow

研究表明，大部分由乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素含有堿性氨基酸，在酸性及中性的條件下帶正電荷，能夠被陽(yáng)離子層析柱吸附。將Sephadex G-10柱色譜脫鹽并純化得到的細(xì)菌素粗品在pH 3.8的條件下進(jìn)行SP Sepherose Fast Flow分離純化[17,21]，如圖5所示，將收集液通過(guò)牛津杯法測(cè)定抑菌活性，結(jié)果表明抑菌活性區(qū)域在主要分離峰后面（圖5陰影部分），說(shuō)明Pentocin LS1對(duì)陽(yáng)離子柱SP Sepharose Fast Flow的吸附能力較其他雜蛋白強(qiáng)，洗脫下來(lái)活性位置在主洗脫峰后面，說(shuō)明大部分雜蛋白已經(jīng)除去，有利于后期的分離純化。經(jīng)過(guò)SP Spharose Fast Flow離子層析柱，可以從上清液中分離出大部分有活性的細(xì)菌素，細(xì)菌素的比活力是原發(fā)酵上清液的28.4 倍。

2.3.4 Superdex 30 Increase分離純化細(xì)菌素

圖6 Superdex 30 Increase分離純化Pentocin LS1的色譜圖Fig.6 Chromatogram obtained from purification of pentocin LS1 by Superdex 30 Increase

由電泳所得bacteriocin-LS1估測(cè)分子質(zhì)量，采用Superdex 30 Increase作為最后一步純化，分離過(guò)程如圖6所示。可以看出活性主要集中在463～469 mL。采用牛津杯的方法，對(duì)分離純化各個(gè)步驟進(jìn)行取樣測(cè)定活性，結(jié)果如表2和圖7所示，Pentocin LS1比活力逐漸增大，Superdex 30 Increase雖然得率低，只有2.1 mg，但其獲得了110.5 倍純化，Pentocin LS1比活力達(dá)到了1 238.1 AU/mg，說(shuō)明在分離小分子物質(zhì)中凝膠層析能夠起到更明顯的分離作用。

表2 細(xì)菌素LS1的分離純化Table 2 Summary of purification steps of pentocin LS1

圖7 分離純化后細(xì)菌素的抑菌結(jié)果Fig.7 Antibacterial effect of pentocin LS1 after separation and purification

2.4 HPLC檢測(cè)細(xì)菌素純度

圖8 Pentocin LS1的HPLC圖譜Fig.8 Analytical RP-HPLC profile of pentocin LS1

HPLC具有高分辨率的特征，能夠檢測(cè)出細(xì)菌素的純度[18,22-23]。利用樣品的極性和疏水性進(jìn)行分離，經(jīng)過(guò)Superdex 30 Increase純化后的樣品經(jīng)過(guò)HPLC分析（圖8），在6.7 min處出峰，峰形較好，沒(méi)有出現(xiàn)明顯雜峰，說(shuō)明得到了較高純度的Pentocin LS1。

2.5 質(zhì)譜分析

經(jīng)過(guò)Superdex 30 Increase分離純化后的細(xì)菌素樣品進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，得出Pentocin LS1的分子質(zhì)量為1 123.8 Da。對(duì)1 123.8 Da的峰再次進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到二級(jí)質(zhì)譜圖（圖9）。通過(guò)Peaks 7.0軟件對(duì)該細(xì)菌素的二級(jí)質(zhì)譜片段進(jìn)行分析得出該細(xì)菌素的氨基酸序列為ACDFCFCGMK。將Pentocin LS1氨基酸序列在GenBank和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLASTP搜索相同序列，結(jié)果顯示Pentocin LS1沒(méi)有相同的匹配的序列，表明Pentocin LS1是一種新型的戊糖乳桿菌素。

圖9 細(xì)菌素Pentocin LS1的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.9 Mass spectrum of pentocin LS1

2.6 Pentocin LS1的抑菌譜

具有廣泛抗菌活性的細(xì)菌素在食品工業(yè)中具有應(yīng)用價(jià)值。Pentocin LS1具有廣泛的抗微生物譜（表3）。它能夠強(qiáng)烈抑制一些革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如單核細(xì)胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌；同時(shí)它能抑制革蘭氏陰性細(xì)菌，包括大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞桿菌。此外，它對(duì)乳酸菌屬的一些菌株也有一定的抑制作用；然而，它不能抑制酵母和霉菌。

表3 Bacteriocin-LS1抑菌譜Table 3Antimicrobial spectrum of bacteriocin-LS1

2.7 Pentocin LS1對(duì)溫度、pH值、化學(xué)試劑、蛋白酶敏感性

表4 Pentocin LS1對(duì)溫度、pH值、化學(xué)試劑、蛋白酶的敏感性Table 4 Effects of heating temperature, pH, chemical reagents, and enzymes on antibacterial activity of pentocin LS1

如表4所示，在所研究溫度下均保持活性，Pentocin LS1能夠在巴氏殺菌下更穩(wěn)定，100 ℃加熱15 min仍保留80.2%的抑菌活性，但在121 ℃高壓滅菌15 min后活性損失較大；在接觸各種化學(xué)品后，Pentocin LS1也保持了幾乎100%的活性。用蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶處理導(dǎo)致完全喪失活性；用脂肪酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、透明質(zhì)酸酶、過(guò)氧化氫酶進(jìn)行酶處理后幾乎無(wú)活性損失，從而證實(shí)了其蛋白質(zhì)性質(zhì)。細(xì)菌素Pentocin LS1的抑菌活性在pH 2.0～8.0時(shí)保持相對(duì)穩(wěn)定，但其活性在pH 10.0～12.0顯著降低，這種對(duì)酸的抗性可能適合于食品的制造和保存。

3 討 論

目前許多研究已經(jīng)采用不同的方法純化由乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素[24-26]。本研究第1步采用硫酸銨法獲得6.0 倍純化，具有工作條件溫和、成本效益高、結(jié)果快速生成、最終產(chǎn)品回收率高的優(yōu)點(diǎn)。Rumjuankiat等[27]使用硫酸銨沉淀作為提取細(xì)菌素的第一純化步驟，僅獲得1.5 倍的純化；然后采用Sephadex G-10柱色譜進(jìn)行純化，在脫鹽的同時(shí)達(dá)到了分離純化的目的，較目前常用的透析袋脫鹽有著脫鹽效果好、快速等特點(diǎn)；而最后一步精細(xì)純化采用Superdex 30 Increase得到了純度較高的細(xì)菌素，劉輝[17]在最后一步精細(xì)純化也用該方法獲得了高純度細(xì)菌素。

通過(guò)質(zhì)譜法測(cè)得戊糖乳桿菌素Pentocin LS1分子質(zhì)量為1 123.8 Da。關(guān)于從戊糖乳桿菌中純化細(xì)菌素并獲得準(zhǔn)確分子質(zhì)量的報(bào)道較少，其中有Pentocin MQ1[28]（2 110.672 Da）、Pentocin TV35b[11]（3 929.63 Da）、Pentocin 31-1[29]（5 592.225 Da）、Pentocin K2N7[30]（2.017 kDa）和Pentocin JL-1[31]（2 987.23 Da）。戊糖乳桿菌素Pentocin LS1分子質(zhì)量與任何已報(bào)道的戊糖乳桿菌素均不匹配，同時(shí)將Pentocin LS1氨基酸序列在GenBank和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLASTP搜索相同序列，結(jié)果顯示Pentocin LS1沒(méi)有相同的匹配的序列，表明Pentocin LS1是一種新型的戊糖乳桿菌素。

Pentocin LS1具有廣泛的抑菌活性，對(duì)一些革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。Zhang Jinlan等[29]也報(bào)道了Pentocin 31-1是一種廣譜細(xì)菌素，對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑制活性。Watthanasakphuban等[30]報(bào)道Pentocin K2N7具有較窄的抑菌活性，對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均沒(méi)有抑制作用，但對(duì)乳酸菌屬的一些菌株顯示出抑制作用。Wayah等[28]研究得出Pentocin MQ1是一種廣譜細(xì)菌素，對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞桿菌具有抑制活性，并且能夠抑制植物乳桿菌K25。Pentocin LS1能夠強(qiáng)烈抑制一些革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如單核細(xì)胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌；同時(shí)它能抑制革蘭氏陰性細(xì)菌，包括大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞桿菌。此外，它對(duì)乳酸菌屬的一些菌株也有一定的抑制作用；然而，它與大多數(shù)細(xì)菌素一樣都不能抑制酵母和霉菌。廣泛的抗菌活性是選擇細(xì)菌素用于食品保存的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[32-33]，Pentocin LS1的廣泛抗菌譜很好地表明它是食品防腐劑的良好候選者。Pentocin LS1對(duì)所研究的化學(xué)處理均高度穩(wěn)定，同時(shí)具有很高的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性，在pH 2.0～10.0和40～121 ℃仍具有活性。已報(bào)道的Pentocin TV35b在pH 1.0～10.0和60～100 ℃溫度處理后具有活性[11]；Pentocin 31-1與Pentocin LS1具有相似的穩(wěn)定性都在pH 2.0～10.0和60～121 ℃時(shí)具有活性[29]；Pentocin MQ1在40～120 ℃有抑菌活性，在pH 10時(shí)無(wú)活性，但用化學(xué)試劑處理后仍具有穩(wěn)定性[28]；Pentocin K2N7在pH 2.0～12.0時(shí)保持活性，但在121 ℃時(shí)無(wú)活性[30]。Pentocin LS1對(duì)化學(xué)，pH值和熱穩(wěn)定的屬性有利于其在食品加工中的應(yīng)用[34]，同時(shí)其本質(zhì)為多肽，具有對(duì)蛋白酶敏感的的特性，降低其對(duì)有益腸道菌群的抑制，從而提高了其安全性[35]。

4 結(jié) 論

利用16S rDNA基因序列對(duì)從酸菜水中分離出的1 株產(chǎn)細(xì)菌素菌株LS1進(jìn)行鑒定，最終鑒定該菌為戊糖乳桿菌。細(xì)菌素依次通過(guò)硫酸銨沉淀取上清液經(jīng)Sephadex G-10柱色譜脫鹽并純化，然后SP Sepharose Fast Flow中度純化，最后Superdex 30 Increase精細(xì)純化。純化后比活力1 238.1 AU/mg，是原始活性的110.5 倍。根據(jù)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定細(xì)菌素分子質(zhì)量為1 123.8 Da，氨基酸序列為ACDFCFCGMK。細(xì)菌素Pentocin LS1對(duì)溫度、pH值、化學(xué)試劑都有很好的穩(wěn)定性，且能夠被腸道中的酶滅活，同時(shí)對(duì)一些食品致病菌有著較強(qiáng)的抑制作用，在食品防腐和保鮮方面有著重要意義。