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        戊糖乳桿菌LS1細(xì)菌素的分離純化及性質(zhì)鑒定

        2020-10-28 07:13:54李志如韓建春劉容旭劉丹怡梁君鋒
        食品科學(xué) 2020年20期
        關(guān)鍵詞:戊糖脫鹽硫酸銨

        李志如,韓建春,,,劉容旭,劉丹怡,梁君鋒

        (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院,黑龍江 哈爾濱 150028)

        細(xì)菌素是一種小分子質(zhì)量生物活性抗菌肽,在許多細(xì)菌的核糖體中合成并在細(xì)胞外釋放。細(xì)菌素能夠殺死或抑制原核生物的生長(zhǎng),有助于抵抗病原體和一些具有抗生素抗性的細(xì)菌菌株[1]。細(xì)菌素與合成藥物和化學(xué)防腐劑不同,即使在低劑量下,細(xì)菌素仍然具有快速和強(qiáng)效的作用[2],并且不會(huì)顯著改變?nèi)梭w腸道的微生物群[3-4]。其新的作用模式和對(duì)一些致病性細(xì)菌具有抑制作用,使其在食品防腐和保鮮方面?zhèn)涫荜P(guān)注[5-6]。其中乳酸菌細(xì)菌素通常被認(rèn)為是安全的[7],目前產(chǎn)細(xì)菌素戊糖乳桿菌已有許多文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]。其中Okkers[11]對(duì)Pentocin TV35b進(jìn)行純化;呂燕妮[12]對(duì)Pentocin 31-1分離純化。戊糖乳桿菌素多具耐熱性高、分子質(zhì)量小、在酸性或弱堿性條件下穩(wěn)定的特點(diǎn)[13],具有廣泛的抑菌譜并且對(duì)一些食品致病菌具有較強(qiáng)的抑制作用[14],對(duì)于食品和制藥工業(yè)都具有重要意義。

        本研究主要對(duì)從酸菜水中得到的乳酸菌進(jìn)行16S rDNA鑒定并測(cè)定其生長(zhǎng)曲線,然后從其發(fā)酵液中分離純化細(xì)菌素,測(cè)定其分子質(zhì)量。同時(shí)研究溫度、pH值、酶和化學(xué)試劑對(duì)該細(xì)菌素抑菌效果的影響。目的是研究細(xì)菌素的有效分離和純化方法以及生物學(xué)特性,為其進(jìn)一步研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)LS1分離自酸菜水;指示菌單核細(xì)胞性李斯特菌(Listeria monocytogenes)CMCC54004和大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC25922均保藏于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院教育部乳品科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

        乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品、H2O2酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K 美國(guó)Sigma公司;醋酸鈉、冰乙酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純;乙腈、三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)和甲醇均為色譜純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        SP Sepharose Fast Flow填料、Superdex 30 Increase層析柱、GE AKTA pure 150蛋白純化液相色譜系統(tǒng) 瑞典GE Healthcare公司;3-30KS高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;Pilot5-8ES真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Ultimate3000高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀 德國(guó)Thermo Fisher公司。

        1.3 方法

        1.3.1 戊糖乳桿菌LS1生長(zhǎng)與拮抗活性曲線

        將活化后的戊糖乳桿菌LS1接種到MRS液體培養(yǎng)基中,并培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(108CFU/mL)。接種3%種子液于250 mL MRS培養(yǎng)基,每2 h(0~48 h)取發(fā)酵液5 mL。稀釋后,用MRS培養(yǎng)基作空白對(duì)照,測(cè)定OD600nm值;每6 h(0~48 h)取發(fā)酵液5 mL測(cè)定pH值,8 000 r/min離心15 min取上清液,通過(guò)瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測(cè)定抑菌活性,以單核細(xì)胞性李斯特菌CMCC 54004為指示菌。

        1.3.2 產(chǎn)細(xì)菌素菌株鑒定

        采用16S rDNA鑒定,參照J(rèn)ang等[15]方法,離心收集菌體后,用DNA提取試劑盒,提取出菌株DNA,引物為27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’),送于吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。

        1.3.3 發(fā)酵上清液制備

        將5%的戊糖乳桿菌LS1(18 h細(xì)胞年齡)培養(yǎng)物接種到MRS肉湯上,37 ℃培養(yǎng)42 h,8 000 r/min離心15 min后,通過(guò)0.22 μm膜過(guò)濾得到上清液與菌體,取上清液用3.0 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)至6.5,凍干備用。

        1.3.4 細(xì)菌素分離純化

        1.3.4.1 硫酸銨粗提細(xì)菌素

        取15 g凍干樣品溶于1 000 mL去離子水,用20%、40%、60%、80%飽和度的硫酸銨,在轉(zhuǎn)速120 r/min條件下攪拌24 h,然后10 000 r/min、4 ℃離心20 min,通過(guò)0.22 μm孔徑的硝酸纖維素膜過(guò)濾分別得到上清液與沉淀,以單核細(xì)胞性李斯特菌CMCC54004和大腸桿菌ATCC25922為指示菌,采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法分別測(cè)定沉淀復(fù)溶液與上清液的抑菌圈直徑,并以沒(méi)有接菌的培養(yǎng)基經(jīng)硫酸銨沉淀后的沉淀復(fù)溶液作空白對(duì)照,選取硫酸銨溶液的最佳飽和度。

        1.3.4.2 Sephadex G-10柱色譜脫鹽及純化

        將60%飽和度硫酸銨進(jìn)行沉淀,離心過(guò)濾后的上清液通過(guò)Sephadex G-10柱色譜系統(tǒng)脫鹽并純化,以超純水為緩沖液,流速為6 mL/min,然后通過(guò)280 nm波長(zhǎng)檢測(cè)細(xì)菌素,采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測(cè)定其抑菌活性。

        1.3.4.3 SP Sepharose Fast Flow純化

        參照Tahiri等[16]方法并稍作修改,將從Sephadex G-10柱色譜系統(tǒng)純化獲得初步純化細(xì)菌素通過(guò)20 mmol/L醋酸鹽沖液(pH 3.8)平衡的SP-Sepherose Fast Flow進(jìn)行純化。用NaCl梯度(0~0.5 mol/L)線性洗脫細(xì)菌素,流速為5 mL/min。然后通過(guò)280 nm波長(zhǎng)紫外檢測(cè)細(xì)菌素,并測(cè)定其抑菌活性。然后合并活性級(jí)分,用Sephadex G-10柱色譜系統(tǒng)脫鹽后,真空冷凍干燥。

        1.3.4.4 Superdex 30 Increase分離純化細(xì)菌素

        參照劉輝[17]方法并稍作修改,用5 mL醋酸鹽緩沖液溶解凍干樣品,使用Superdex 30 Increase,平衡2 個(gè)柱體積,在pH 5.2條件下洗脫,洗脫體積為1.5 CV,通過(guò)紫外280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)菌素,流速1 mL/min,每6 mL為一管進(jìn)行收集,通過(guò)瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測(cè)定其抑菌活性。

        1.3.5 細(xì)菌素純度的檢測(cè)

        參照Ullah等[18]并稍作修改,取純化后獲得的活性峰樣品,使用HPLC測(cè)其純度。平衡液A:超純水+0.1% TFA;洗脫液B:純乙腈+0.1% TFA;上樣量為20 μL,以1.0 mL/min的流速,洗脫程序?yàn)?~5 min,95% A,5% B;5~20 min,95%~0% A,5%~100% B。采用Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),在215 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外檢測(cè)。

        1.3.6 質(zhì)譜分析

        參照劉輝[17]方法并稍作修改,采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定從Superdex 30 Increase分離純化得到的細(xì)菌素Pentocin LS1分子質(zhì)量。上樣為20 μL,洗脫條件為5%~90%乙腈溶液,洗脫時(shí)間60 min,總離子流圖m/z340~2 000,通過(guò)數(shù)據(jù)依賴采集模式收集數(shù)據(jù)。二級(jí)質(zhì)譜是采用誘導(dǎo)碰撞解離(collision-induced dissociation,CID)方式捕捉二級(jí)質(zhì)譜中的b和y離子,通過(guò)Peaks 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析[19]。

        1.3.7 抑菌譜

        將所有指示菌在37 ℃培養(yǎng)24 h后,稀釋至106CFU/mL,制備涂布有不同細(xì)菌的指示平板。在不同指示平板上通過(guò)牛津杯擴(kuò)散法檢測(cè)發(fā)酵上清液樣品對(duì)不同指示菌是否產(chǎn)生抑菌圈,并測(cè)量抑菌圈直徑。

        1.3.8 細(xì)菌素穩(wěn)定性分析

        按照Ge Jingping等[20]方法進(jìn)行細(xì)菌素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。將細(xì)菌素置于40、60、80 ℃持續(xù)30 min以及100、121 ℃持續(xù)15 min,在將樣品冷卻至室溫后測(cè)試抑制活性。通過(guò)添加不同的酶測(cè)試細(xì)菌素對(duì)酶的敏感性,即蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、透明質(zhì)酸酶、過(guò)氧化氫酶,使最終酶質(zhì)量濃度為1 mg/mL,然后在37 ℃將該溶液溫育1 h后,測(cè)試抑制活性。將細(xì)菌素調(diào)節(jié)至各種pH值(2、3、5、8和10),然后在室溫下溫育2 h,測(cè)試抑制活性。接觸不同化學(xué)品時(shí)細(xì)菌素的穩(wěn)定性,即1%(V/V)吐溫80、1%(V/V)Triton X-100、1 mg/mL十二烷基硫酸鈉,通過(guò)將這些化學(xué)物質(zhì)添加到細(xì)菌素中然后在室溫下孵育2 h然后測(cè)定抑制活性。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        2 結(jié)果與分析

        2.1 戊糖乳桿菌LS1生長(zhǎng)與拮抗活性曲線

        圖1 LS1菌株的生長(zhǎng)及拮抗活性曲線Fig.1 Growth rate and antagonistic activity curves of strain LS1

        將戊糖乳桿菌LS1在37 ℃條件下培養(yǎng),其生長(zhǎng)曲線見圖1。在培養(yǎng)2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體數(shù)量迅速增加,在22 h達(dá)到峰值,然后逐漸平緩,到達(dá)穩(wěn)定期;pH值從第6小時(shí)開始快速下降,24 h后逐漸穩(wěn)定至3.7左右;培養(yǎng)18 h后出現(xiàn)明顯抑菌圈,在第42小時(shí)抑菌直徑達(dá)到峰值為20.51 mm,隨后趨于平緩,說(shuō)明抑菌活性物質(zhì)主要在發(fā)酵后期產(chǎn)生。

        2.2 乳酸菌菌種的鑒定

        以2%瓊脂糖凝膠對(duì)提取菌株DNA后擴(kuò)增片段進(jìn)行電泳,得到約1 500 bp的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)片段,結(jié)果見圖2。

        圖2 LS1菌株的16S rDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis patterns of PCR-amplified fragments from LS1 strain

        將PCR的產(chǎn)物在吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序,將測(cè)序的結(jié)果輸入到www.NCBI.nlm.nih.gov,進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,得到菌株的相似度。根據(jù)同源性分析發(fā)現(xiàn)LS1屬于戊糖乳桿菌,相似度達(dá)到99%,采用MEGA 7.0軟件,鄰接算法構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖3。

        圖3 LS1菌株的16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain LS1 based on the 16S rDNA gene sequence

        2.3 細(xì)菌素的分離純化

        2.3.1 硫酸銨粗提細(xì)菌素

        由表1可知,分別用飽和度為20%、40%、60%硫酸銨,得到的沉淀量隨硫酸銨飽和度增加而增加,但均沒(méi)有明顯抑菌圈,上清液中出現(xiàn)較大抑菌圈并且差異不顯著;在硫酸銨飽和度為60%時(shí),對(duì)大腸桿菌抑菌直徑為17.60 mm,對(duì)單核細(xì)胞性李斯特抑菌直徑為20.15 mm。當(dāng)硫酸銨飽和度增加到80%時(shí),沉淀中出現(xiàn)抑菌圈,相應(yīng)地在上清液中抑菌圈減小。說(shuō)明在硫酸銨飽和度達(dá)到80%以后發(fā)酵上清液中的細(xì)菌素就會(huì)被逐漸沉淀出來(lái)。故選擇60%硫酸銨既能夠保證將細(xì)菌素留在上清液中又能夠最大程度地將雜蛋白沉淀除去。

        表1 不同飽和度的硫酸銨沉淀細(xì)菌素結(jié)果Table 1 Results of bacteriocin precipitation using different degrees of ammonium sulfate saturation

        2.3.2 Sephadex G-10柱色譜脫鹽并純化

        圖4 Pentocin LS1的Sephadex G-10層析圖譜Fig.4 Ion-exchange chromatogram of pentocin LS1 on Sephadex G-10

        由于60%硫酸銨沉淀除雜上清液中含有大量鹽,選用Sephadex G-10柱色譜進(jìn)行脫鹽。得到P1、P2兩個(gè)較大的紫外峰(圖4),P2無(wú)明顯抑菌圈而且與鹽峰重合;P1峰形較好,能夠較好地與分子質(zhì)量較小雜蛋白分開,對(duì)大腸桿菌和單核細(xì)胞性李斯特菌抑菌活性分別為25.62 mm和17.88 mm;故選擇峰P1進(jìn)行下一步純化。

        2.3.3 SP Sepharose Fast Flow純化抗菌肽

        圖5 Pentocin LS1的SP Sepharose Fast Flow層析圖譜Fig.5 Ion-exchange chromatogram of pentocin LS1 on SP Sepharose Fast Flow

        研究表明,大部分由乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素含有堿性氨基酸,在酸性及中性的條件下帶正電荷,能夠被陽(yáng)離子層析柱吸附。將Sephadex G-10柱色譜脫鹽并純化得到的細(xì)菌素粗品在pH 3.8的條件下進(jìn)行SP Sepherose Fast Flow分離純化[17,21],如圖5所示,將收集液通過(guò)牛津杯法測(cè)定抑菌活性,結(jié)果表明抑菌活性區(qū)域在主要分離峰后面(圖5陰影部分),說(shuō)明Pentocin LS1對(duì)陽(yáng)離子柱SP Sepharose Fast Flow的吸附能力較其他雜蛋白強(qiáng),洗脫下來(lái)活性位置在主洗脫峰后面,說(shuō)明大部分雜蛋白已經(jīng)除去,有利于后期的分離純化。經(jīng)過(guò)SP Spharose Fast Flow離子層析柱,可以從上清液中分離出大部分有活性的細(xì)菌素,細(xì)菌素的比活力是原發(fā)酵上清液的28.4 倍。

        2.3.4 Superdex 30 Increase分離純化細(xì)菌素

        圖6 Superdex 30 Increase分離純化Pentocin LS1的色譜圖Fig.6 Chromatogram obtained from purification of pentocin LS1 by Superdex 30 Increase

        由電泳所得bacteriocin-LS1估測(cè)分子質(zhì)量,采用Superdex 30 Increase作為最后一步純化,分離過(guò)程如圖6所示。可以看出活性主要集中在463~469 mL。采用牛津杯的方法,對(duì)分離純化各個(gè)步驟進(jìn)行取樣測(cè)定活性,結(jié)果如表2和圖7所示,Pentocin LS1比活力逐漸增大,Superdex 30 Increase雖然得率低,只有2.1 mg,但其獲得了110.5 倍純化,Pentocin LS1比活力達(dá)到了1 238.1 AU/mg,說(shuō)明在分離小分子物質(zhì)中凝膠層析能夠起到更明顯的分離作用。

        表2 細(xì)菌素LS1的分離純化Table 2 Summary of purification steps of pentocin LS1

        圖7 分離純化后細(xì)菌素的抑菌結(jié)果Fig.7 Antibacterial effect of pentocin LS1 after separation and purification

        2.4 HPLC檢測(cè)細(xì)菌素純度

        圖8 Pentocin LS1的HPLC圖譜Fig.8 Analytical RP-HPLC profile of pentocin LS1

        HPLC具有高分辨率的特征,能夠檢測(cè)出細(xì)菌素的純度[18,22-23]。利用樣品的極性和疏水性進(jìn)行分離,經(jīng)過(guò)Superdex 30 Increase純化后的樣品經(jīng)過(guò)HPLC分析(圖8),在6.7 min處出峰,峰形較好,沒(méi)有出現(xiàn)明顯雜峰,說(shuō)明得到了較高純度的Pentocin LS1。

        2.5 質(zhì)譜分析

        經(jīng)過(guò)Superdex 30 Increase分離純化后的細(xì)菌素樣品進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析,得出Pentocin LS1的分子質(zhì)量為1 123.8 Da。對(duì)1 123.8 Da的峰再次進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析,得到二級(jí)質(zhì)譜圖(圖9)。通過(guò)Peaks 7.0軟件對(duì)該細(xì)菌素的二級(jí)質(zhì)譜片段進(jìn)行分析得出該細(xì)菌素的氨基酸序列為ACDFCFCGMK。將Pentocin LS1氨基酸序列在GenBank和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLASTP搜索相同序列,結(jié)果顯示Pentocin LS1沒(méi)有相同的匹配的序列,表明Pentocin LS1是一種新型的戊糖乳桿菌素。

        圖9 細(xì)菌素Pentocin LS1的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.9 Mass spectrum of pentocin LS1

        2.6 Pentocin LS1的抑菌譜

        具有廣泛抗菌活性的細(xì)菌素在食品工業(yè)中具有應(yīng)用價(jià)值。Pentocin LS1具有廣泛的抗微生物譜(表3)。它能夠強(qiáng)烈抑制一些革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,如單核細(xì)胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌;同時(shí)它能抑制革蘭氏陰性細(xì)菌,包括大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞桿菌。此外,它對(duì)乳酸菌屬的一些菌株也有一定的抑制作用;然而,它不能抑制酵母和霉菌。

        表3 Bacteriocin-LS1抑菌譜Table 3Antimicrobial spectrum of bacteriocin-LS1

        2.7 Pentocin LS1對(duì)溫度、pH值、化學(xué)試劑、蛋白酶敏感性

        表4 Pentocin LS1對(duì)溫度、pH值、化學(xué)試劑、蛋白酶的敏感性Table 4 Effects of heating temperature, pH, chemical reagents, and enzymes on antibacterial activity of pentocin LS1

        如表4所示,在所研究溫度下均保持活性,Pentocin LS1能夠在巴氏殺菌下更穩(wěn)定,100 ℃加熱15 min仍保留80.2%的抑菌活性,但在121 ℃高壓滅菌15 min后活性損失較大;在接觸各種化學(xué)品后,Pentocin LS1也保持了幾乎100%的活性。用蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶處理導(dǎo)致完全喪失活性;用脂肪酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、透明質(zhì)酸酶、過(guò)氧化氫酶進(jìn)行酶處理后幾乎無(wú)活性損失,從而證實(shí)了其蛋白質(zhì)性質(zhì)。細(xì)菌素Pentocin LS1的抑菌活性在pH 2.0~8.0時(shí)保持相對(duì)穩(wěn)定,但其活性在pH 10.0~12.0顯著降低,這種對(duì)酸的抗性可能適合于食品的制造和保存。

        3 討 論

        目前許多研究已經(jīng)采用不同的方法純化由乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素[24-26]。本研究第1步采用硫酸銨法獲得6.0 倍純化,具有工作條件溫和、成本效益高、結(jié)果快速生成、最終產(chǎn)品回收率高的優(yōu)點(diǎn)。Rumjuankiat等[27]使用硫酸銨沉淀作為提取細(xì)菌素的第一純化步驟,僅獲得1.5 倍的純化;然后采用Sephadex G-10柱色譜進(jìn)行純化,在脫鹽的同時(shí)達(dá)到了分離純化的目的,較目前常用的透析袋脫鹽有著脫鹽效果好、快速等特點(diǎn);而最后一步精細(xì)純化采用Superdex 30 Increase得到了純度較高的細(xì)菌素,劉輝[17]在最后一步精細(xì)純化也用該方法獲得了高純度細(xì)菌素。

        通過(guò)質(zhì)譜法測(cè)得戊糖乳桿菌素Pentocin LS1分子質(zhì)量為1 123.8 Da。關(guān)于從戊糖乳桿菌中純化細(xì)菌素并獲得準(zhǔn)確分子質(zhì)量的報(bào)道較少,其中有Pentocin MQ1[28](2 110.672 Da)、Pentocin TV35b[11](3 929.63 Da)、Pentocin 31-1[29](5 592.225 Da)、Pentocin K2N7[30](2.017 kDa)和Pentocin JL-1[31](2 987.23 Da)。戊糖乳桿菌素Pentocin LS1分子質(zhì)量與任何已報(bào)道的戊糖乳桿菌素均不匹配,同時(shí)將Pentocin LS1氨基酸序列在GenBank和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLASTP搜索相同序列,結(jié)果顯示Pentocin LS1沒(méi)有相同的匹配的序列,表明Pentocin LS1是一種新型的戊糖乳桿菌素。

        Pentocin LS1具有廣泛的抑菌活性,對(duì)一些革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。Zhang Jinlan等[29]也報(bào)道了Pentocin 31-1是一種廣譜細(xì)菌素,對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌,金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑制活性。Watthanasakphuban等[30]報(bào)道Pentocin K2N7具有較窄的抑菌活性,對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均沒(méi)有抑制作用,但對(duì)乳酸菌屬的一些菌株顯示出抑制作用。Wayah等[28]研究得出Pentocin MQ1是一種廣譜細(xì)菌素,對(duì)單核細(xì)胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞桿菌具有抑制活性,并且能夠抑制植物乳桿菌K25。Pentocin LS1能夠強(qiáng)烈抑制一些革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,如單核細(xì)胞性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌;同時(shí)它能抑制革蘭氏陰性細(xì)菌,包括大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞桿菌。此外,它對(duì)乳酸菌屬的一些菌株也有一定的抑制作用;然而,它與大多數(shù)細(xì)菌素一樣都不能抑制酵母和霉菌。廣泛的抗菌活性是選擇細(xì)菌素用于食品保存的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[32-33],Pentocin LS1的廣泛抗菌譜很好地表明它是食品防腐劑的良好候選者。Pentocin LS1對(duì)所研究的化學(xué)處理均高度穩(wěn)定,同時(shí)具有很高的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性,在pH 2.0~10.0和40~121 ℃仍具有活性。已報(bào)道的Pentocin TV35b在pH 1.0~10.0和60~100 ℃溫度處理后具有活性[11];Pentocin 31-1與Pentocin LS1具有相似的穩(wěn)定性都在pH 2.0~10.0和60~121 ℃時(shí)具有活性[29];Pentocin MQ1在40~120 ℃有抑菌活性,在pH 10時(shí)無(wú)活性,但用化學(xué)試劑處理后仍具有穩(wěn)定性[28];Pentocin K2N7在pH 2.0~12.0時(shí)保持活性,但在121 ℃時(shí)無(wú)活性[30]。Pentocin LS1對(duì)化學(xué),pH值和熱穩(wěn)定的屬性有利于其在食品加工中的應(yīng)用[34],同時(shí)其本質(zhì)為多肽,具有對(duì)蛋白酶敏感的的特性,降低其對(duì)有益腸道菌群的抑制,從而提高了其安全性[35]。

        4 結(jié) 論

        利用16S rDNA基因序列對(duì)從酸菜水中分離出的1 株產(chǎn)細(xì)菌素菌株LS1進(jìn)行鑒定,最終鑒定該菌為戊糖乳桿菌。細(xì)菌素依次通過(guò)硫酸銨沉淀取上清液經(jīng)Sephadex G-10柱色譜脫鹽并純化,然后SP Sepharose Fast Flow中度純化,最后Superdex 30 Increase精細(xì)純化。純化后比活力1 238.1 AU/mg,是原始活性的110.5 倍。根據(jù)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定細(xì)菌素分子質(zhì)量為1 123.8 Da,氨基酸序列為ACDFCFCGMK。細(xì)菌素Pentocin LS1對(duì)溫度、pH值、化學(xué)試劑都有很好的穩(wěn)定性,且能夠被腸道中的酶滅活,同時(shí)對(duì)一些食品致病菌有著較強(qiáng)的抑制作用,在食品防腐和保鮮方面有著重要意義。

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