史瑞琴，梁靜靜，李大偉，王 頡，郭書賢，馬艷莉,

（1.南陽理工學院 河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南 南陽 473004；2.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000）

小球藻（Chlorella）是綠球藻目中的常見植物，屬綠藻門，小球藻屬，又稱綠藻，它是地球上最早的生命形式之一，它是日本、中國等亞洲國家的傳統(tǒng)食品[1]。多糖是小球藻中重要的營養(yǎng)物質(zhì)，占小球藻粉的10%～20%，具有抗衰老、抗氧化及增強免疫等生物活性功能[2-5]。目前，市場上除小球藻片劑、膠囊等早期產(chǎn)品外，許多研究者還對小球藻飲料、面包、餅干等產(chǎn)品進行了深入研究[6-7]，但對小球藻多糖類食品及多糖的理化特性鮮有報道。

近年來，已有研究證實多糖的結(jié)構(gòu)與理化特性均會影響其在食品中的活性表征[8]。另外，在多糖類食品的加工過程中，為了降低加工能耗、增加產(chǎn)品口感，可通過更改施加的剪切應力調(diào)整溶液黏性[9]。天然多糖獨特的流變學特性的研究可以預測其凝膠化或增稠性質(zhì)，這不僅有助于食品的制造、分配、貯存和消費，而且有益于天然的凝膠劑、增稠劑或乳化劑的研發(fā)[10]。因此，為了提高多糖產(chǎn)品的種類及應用，減少制作過程中的能量消耗，需要對小球藻多糖的理化性質(zhì)進行初步研究。

為了進一步探索小球藻多糖的應用價值，本實驗首先通過酶法提取小球藻粉中的粗多糖，探討了不同脫蛋白方法對小球藻多糖的影響，確定離子交換柱層析獲得的純化多糖中是否含有大量蛋白以及是否為均一性組分。同時研究不同純化多糖的微觀形態(tài)、單糖組成、流變學等特性，這對于擴大小球藻在食品領(lǐng)域中的應用具有重要的意義及參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻粉 西安仁邦生物科技有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA） 天津市福晨化學試劑廠；氯仿、正丁醇 天津市科密歐化學試劑有限公司；纖維素酶（酶活力≥3 000 U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力≥60 000 U/g）、牛血清、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、DEAESepharose Fast Flow、Sephadex G-200填料、單糖標準品北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

H.SWX-600BS恒溫水溫箱 常州朗博儀器制造有限公司；Ne-ofuge 15R冷凍離心機 上海力申科學儀器公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 上海天星科學儀器有限公司；BT300-2J凍干機 新陽設備制造有限公司；UV-1700PC紫外-可見分光光度計 上海美析儀器有限公司；S3400N掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本Hitachi公司；Breeze高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；MCR302高級旋轉(zhuǎn)流變儀奧地利安東帕股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小球藻多糖的提取

將小球藻粉與蒸餾水按照質(zhì)量比1∶20混勻，超聲30 min后添加1.45%復合酶（纖維素與木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1∶1）并調(diào)pH 5，酶解30 min后滅酶。使溶液置于70 ℃浸提4 h，4 500 r/min離心15 min，取上清液與3 倍體積乙醇混合并于4 ℃過夜，離心收集醇沉物，復溶后濃縮至原體積的1/2，以便除去樣品中的乙醇，此時粗多糖的提取率可達（6.56±0.52）%。

1.3.2 小球藻多糖的分離純化與鑒定

1.3.2.1 不同脫蛋白方法的比較

TCA法脫蛋白：取10 mL濃縮液置于試管中，添加TCA使其質(zhì)量分數(shù)分別達到1%、2%、3%、4%、5%、6%，4 ℃過夜后于5 000 r/min離心15 min，考察TCA質(zhì)量分數(shù)對溶液中蛋白質(zhì)脫除率與多糖損失率的影響[11]。

Sevag法脫蛋白：向濃縮液中加入1/2體積的Sevag試劑（氯仿-正丁醇（4∶1，V/V）），劇烈振蕩20 min，移入分液漏斗中靜置20 min，棄去中間與下層物質(zhì)，多次重復上述工藝至觀察到無明顯的中間蛋白層[12]，研究脫除蛋白次數(shù)對溶液中蛋白質(zhì)脫除率與多糖損失率的影響。計算如式（1）、（2）所示：

式中：M1、M2分別為脫蛋白前、后溶液中蛋白質(zhì)含量；m1、m2分別為脫蛋白前、后溶液中多糖含量。

1.3.2.2 除雜

脫除蛋白的多糖溶液濃縮并去除有機試劑后，透析48 h，并間隔12 h更換一次蒸餾水，從而除去樣液中的鹽類及小分子物質(zhì)，再濃縮、凍干，即可獲得粗多糖。

1.3.2.3 陰離子交換柱層析

將經(jīng)預處理的50 g DEAE-Sepharose Fast Flow用玻璃棒引流入層析柱（1.6 cm×30 cm），去離子水以12 mL/min流速沖柱5 min，再調(diào)流速至8 mL/min，平衡10 h以上。將10 mL 5 mg/mL粗多糖過0.45 μm水系一次性針頭濾器。上樣后，依次用去離子水與0.5～1.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，控制流速2 mL/min，每管收集5 min，共收集80 管。同時采用苯酚-硫酸法[13]檢測吸光度，并繪制洗脫曲線。收集樣液，透析、濃縮、凍干，即可獲得純化多糖。

1.3.2.4 紫外吸收光譜測定

參照Kia等[14]方法并略加修改。取適量0.1%的純化多糖溶液于比色皿中，測定樣液在200～400 nm波長處的吸光度，以確定純化多糖中蛋白質(zhì)的脫除情況。

1.3.2.5 葡聚糖凝膠柱層析

參照董芳[15]的方法，采用進一步柱層析法檢驗純化多糖是否為均一組分。將經(jīng)預處理的適量Sephadex G-200填料灌入層析柱（1 cm×20 cm）并保證柱內(nèi)無氣泡或斷層，以0.5 mL/min流速平衡。分別將5 mg/mL純化多糖過膜，取1 mL上樣，分別用去離子水和0.2 mol/L NaCl溶液洗脫，流速不變，每管收集3 mL，共收集40 管，依據(jù)溶液的吸光度繪制洗脫曲線。

1.3.3 小球藻多糖的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

1.3.3.1 SEM觀察

將適量已烘干的純化多糖置于銅片上，粘貼固定好后放于鍍金室內(nèi)中，鍍金操作完成后進行SEM并拍照，放大倍數(shù)為500、5 000。

1.3.3.2 HPLC分析

將2 mg純化多糖與0.5 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液混勻，120 ℃水解120 min，氮吹儀吹干。然后向5 μL 10 mg/mL單糖標準品與水解的多糖溶液中加入溶于甲醇的0.5 mol/L PMP試劑和0.3 mol/L NaOH溶液各0.5 mL，70 ℃水浴30 min，冷卻至室溫后，依次添加等體積0.3 mol/L HCl溶液與氯仿，振蕩萃取，離心去除氯仿層，重復萃取3 次，水層過0.22 μm膜后，待上機。

色譜柱：Thermo ODS-2 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液-乙腈（82∶18，V/V）；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；波長245 nm。

1.3.3.3 剛果紅實驗測定

將純化多糖配制成0.5 mg/mL溶液，依次取2 mL多糖、2 mL 60 μmol/L剛果紅及不同體積的2 mol/L NaOH溶液，使得NaOH溶液終濃度分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L，靜置15 min后測定不同濃度NaOH溶液中多糖最大吸收波長的遷移情況[16]。

1.3.4 小球藻多糖的流變學特性

為確定不同質(zhì)量分數(shù)的純化多糖（0.5%、1%、2%）在不同剪切速率（0.1～100 s－1）中的表觀黏度。設置流變儀溫度為25 ℃，測定并繪制純化多糖的剪切速率與黏度的關(guān)系曲線[17]。

為確定不同質(zhì)量分數(shù)的純化多糖（0.5%、1%、2%）在不同角頻率（0.1～100 rad/s）中的儲能模量G’與損耗模量G”的變化。設置溫度為25 ℃，剪切應變?yōu)?.1%，測定并繪制多糖的角頻率與G’、G”的關(guān)系曲線[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應用Origin 8.6計算3 次重復實驗數(shù)據(jù)平均值及標準偏差并繪制折線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化及鑒定分析

2.1.1 脫蛋白方法的選擇

2.1.1.1 TCA法

由圖1可得，蛋白質(zhì)脫除率隨TCA添加量的增加，先快速增加后基本維持于90%以上，最高可達95%。這是利用蛋白質(zhì)陽離子在等電點與TCA結(jié)合形成不溶性鹽[19]。但TCA添加量增加的過程中，多糖損失率在持續(xù)上升且當添加量在2%～5%時，上升趨勢十分明顯，可導致多糖損失率達30%以上。此結(jié)果也驗證了之前報道的結(jié)論[20]。

圖1 TCA法脫蛋白對小球藻多糖的影響Fig.1 Deproteinization efficiency of crude Chlorella polysaccharides with TCA

2.1.1.2 Sevag法

圖2 Sevag法脫蛋白對小球藻多糖的影響Fig.2 Deproteinization efficiency of crude Chlorella polysaccharides by Sevag method

由圖2可知，當采用Sevag法脫蛋白時，隨著脫除蛋白次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)脫除率先緩慢增加后基本穩(wěn)定于90%～95%之間。脫除蛋白次數(shù)小于6 次時，多糖損失率明顯增加，隨后基本保持于25%以下。目前已有研究[21]發(fā)現(xiàn)此法脫蛋白具有一定的優(yōu)勢，而且本實驗結(jié)果也證明循環(huán)6 次Sevag法脫蛋白不但可以使得蛋白質(zhì)脫除率達92.27 %，而且能夠保證多糖損失率相對較低。因此，為了減少TCA試劑對多糖結(jié)構(gòu)的降解，本實驗擬采用Sevag法脫蛋白。

2.1.2 陰離子交換柱層析

圖3 DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析洗脫圖Fig.3 Elution profile of Chlorella polysaccharides by DEAE-Sepharose Fast Flow column chromatography

由圖3可知，小球藻粗多糖經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析可獲得3 種不同級分的純化多糖，分別命名為F1、F2、F3。其中F1為去離子水洗脫獲得的多糖，凍干后為蓬松白色絮狀物，而不同濃度（0.5、1、1.5 mol/L）NaCl溶液洗脫得到的F2與F3凍干后分別為淡黃色和乳白色蓬松絮狀物。

2.1.3 紫外波長掃描

圖4 純化多糖的紫外光譜Fig.4 UV absorption spectra of the purified polysaccharides

溶液在200～300 nm范圍內(nèi)的吸收峰可以驗證多糖中是否含大量的蛋白質(zhì)及核酸[22]。從圖4可以看出，多糖F1、F2、F3在260 nm與280 nm波長處幾乎無明顯的吸收峰，初步表明純化多糖幾乎不含蛋白質(zhì)與核酸。

2.1.4 葡聚糖凝膠柱層析

圖5 Sephadex G-200柱層析洗脫圖Fig.5 Elution profiles of the purified polysaccharides by Sephadex G-200 column chromatography

進一步葡聚糖凝膠滲透色譜上的對稱單峰可以表明多糖接近于均質(zhì)多糖[23]。本實驗用Sephadex G-200層析柱分析。由圖5可知，F(xiàn)1與F2的出峰時間接近，但與洗脫條件相同的F2相比，F(xiàn)3的出峰時間稍晚，由此推測F3的分子質(zhì)量可能會略大于F2。從整體上看，純化多糖均出現(xiàn)峰型基本對稱的單峰，表明其接近于均一性組分。

2.2 結(jié)構(gòu)性質(zhì)

2.2.1 SEM分析

圖6 純化多糖的微觀結(jié)構(gòu)Fig.6 Microstructures of the purified polysaccharides

如圖6A所示，F(xiàn)1表現(xiàn)為纖維細絲狀，提高放大倍數(shù)可見明顯的柱狀結(jié)構(gòu)，且表面平整，表明F1存在大量的分子或分子集團聚集形成的束。如圖6B所示，F(xiàn)2呈現(xiàn)片狀與碎屑狀堆積，而放大5 000 倍時可見大量無規(guī)則交叉連接的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且表面粗糙，說明分子間的相互作用較強。如圖6C所示，F(xiàn)3放大500 倍時呈現(xiàn)片狀堆積，擴大放大倍數(shù)可見明顯的片狀結(jié)構(gòu)表面含有不同層析的凸起，說明此多糖內(nèi)可能存在一些具有一定排斥力的聚集體。

2.2.2 HPLC分析

10 種單糖標準品的出峰時間、回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1，標準品、F1、F2與F3的單糖組成圖譜分別見圖7。不同純化多糖的單糖組成及相對含量結(jié)果見表2，F(xiàn)1中相對含量較高的單糖分別為Gal（62.898%）、Glu（15.439%）和Man（12.665%），F(xiàn)2也含有較多的Gal（41.854%）、Fuc（13.741%）、Rha（10.199%），而F3主要是由Rha（32.33%）、Ara（39.55%）、Gal（10.82%）組成。純化多糖F2與F3均不含Rib，與之不同的是F1不含GlcA。綜上分析可知，小球藻多糖是一種以Gal為主的雜多糖，這與Song Hong等[24]所測結(jié)果相同，但不同于Qi等[25]的結(jié)論。后者認為Glu是優(yōu)勢單糖，并解釋到微藻多糖的化學成分與小球藻物種和生長條件以及提取方法密切相關(guān)。

表1 單糖標準品的HPLC分析Table 1 Calibration equations and peak times of monosaccharide standards analyzed by HPLC

圖7 單糖標準品與純化多糖的HPLC分析Fig.7 HPLC profiles of monosaccharide standards and the purified polysaccharides

表2 純化多糖的HPLC分析Table 2 Monosaccharide composition of the purified polysaccharides determined by HPLC

2.2.3 剛果紅實驗分析

圖8 純化多糖最大吸收波長的變化Fig.8 Change in maximum absorption wavelength of the purified polysaccharides

在堿性介質(zhì)中，剛果紅染料可以與三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖反應形成絡合物而導致溶液的最大吸收波長發(fā)生紅移[26]。由圖8可知，隨著NaOH濃度的增加，純化多糖的最大吸收波長發(fā)生了相同程度的藍移，說明純化多糖在水溶液中不呈現(xiàn)三螺旋結(jié)構(gòu)，而表現(xiàn)為無規(guī)則線團鏈構(gòu)象。

2.3 流變學性質(zhì)

2.3.1 靜態(tài)黏彈性分析

多糖為黏彈性材料，其流變行為除受內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)的影響外，質(zhì)量分數(shù)也是影響流變行為的重要因素之一[27]。由圖9可知，3 種多糖的表觀黏度都與質(zhì)量分數(shù)和剪切速率有關(guān)，且呈現(xiàn)出質(zhì)量分數(shù)的正向變化和剪切速率的負效應。其中F1的黏度變化范圍相對較小，F(xiàn)2與F3的質(zhì)量分數(shù)依賴性會隨著剪切速率的增加而逐漸減弱。這是因為剪切力會破壞許多鏈間結(jié)構(gòu)，導致系統(tǒng)黏度隨剪切速率的增加而降低[28]。依據(jù)非牛頓流體的特征可以確定小球藻多糖溶液為非牛頓流體。

圖9 純化多糖的穩(wěn)態(tài)剪切流動曲線Fig.9 Steady shear flow curves of the purified polysaccharides

2.3.2 動態(tài)黏彈性分析

由圖10A可知，當角頻率低于10 rad/s時，隨著質(zhì)量分數(shù)的增加F1的G’與G”也逐漸增加；當角頻率高于10 rad/s時，質(zhì)量分數(shù)增大雖然使得G”略有增加，但對G’影響不大。當角頻率維持在0.1～10 rad/s之間，F(xiàn)1的G’與G”基本保持穩(wěn)定，而角頻率繼續(xù)增加時，F(xiàn)1的G’與G”均呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。

由圖10B可知，當角頻率不變時，F(xiàn)2的G’與G”與質(zhì)量分數(shù)呈正相關(guān)。當F2的質(zhì)量分數(shù)高于1%時，角頻率對G’與G”的影響相對較小，僅在接近100 rad/s時輕微增長；當質(zhì)量分數(shù)為0.5%時，隨著角頻率的增加，G’與G”展示出明顯的大幅度增加趨勢。

由圖10C可知，與F2表現(xiàn)不同的是，當角頻率在0.1～10 rad/s時，F(xiàn)3的G’與G”的質(zhì)量分數(shù)依賴性不強，但質(zhì)量分數(shù)高于1%時表現(xiàn)出質(zhì)量分數(shù)依賴性增加；當角頻率大于10 rad/s時，質(zhì)量分數(shù)對G’與G”幾乎不產(chǎn)生影響。當F3的質(zhì)量分數(shù)不變時，F(xiàn)3的G’與G′隨角頻率的增加先穩(wěn)定后顯著增強。

在整個動態(tài)變化過程中，若G’＞G”則表現(xiàn)為固體的彈性行為，而G’＜G”表明溶液為類似液體的行為，出現(xiàn)交叉現(xiàn)象則說明多糖為凝膠型多糖[29-30]。綜上所述，相同質(zhì)量分數(shù)的純化多糖始終保持G’＞G”的狀態(tài)，證明小球藻多糖為非凝膠型多糖。

圖10 純化多糖的G’與G”的變化Fig.10 Change in G’ and G” of the purified polysaccharides

3 結(jié) 論

以蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率為指標，通過對比分析TCA法與Sevag法對小球藻多糖的影響，發(fā)現(xiàn)循環(huán)6 次以上的Sevag法效果較好。紫外掃描與Sephadex G-200柱層析的鑒定確定脫除蛋白后的小球藻多糖經(jīng)過DEAESepharose Fast Flow柱層析可以獲得幾乎不含蛋白質(zhì)的3 種均一性多糖。SEM、HPLC以及剛果紅實驗結(jié)果顯示，純化多糖主要以片狀或細絲狀形式存在，在水溶液中不呈三維螺旋結(jié)構(gòu)，且證實了小球藻多糖是以半乳糖為主的雜多糖。流變學性質(zhì)分析探明小球藻純化多糖為非牛頓流體，而且是一類非凝膠型多糖。