程 喆，潘思軼,2,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖北 武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學環(huán)境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

柚皮苷（naringin，NA）是存在于柑橘類水果中的一種極具代表性的天然黃酮類化合物，因其具有抗氧化[1]、抗癌[2]、緩解糖尿病[3]、抗骨質(zhì)疏松[4]、抗炎[5]、抗動脈粥硬化[6]等藥理作用及生物活性而廣受關(guān)注。盡管NA表現(xiàn)出良好的生物活性，但由于其在水中的溶解度以及在人體內(nèi)的吸收率很低，導致口服NA的生物利用效率極低[7]。

近年來，許多研究學者采用納米乳液技術(shù)包埋水溶性低的營養(yǎng)物以提高其生物利用率。而乳化劑對構(gòu)建穩(wěn)定的納米乳液起著至關(guān)重要的作用，乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）作為來源廣泛、安全的大分子乳化劑，具有良好生物兼容性與乳化性，被廣泛應用于穩(wěn)定負載營養(yǎng)物納米乳液的穩(wěn)定劑[8]。納米乳液體系在胃腸道消化過程中可發(fā)生復雜的物理化學和生物學變化[9]，使其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的變化，從而影響納米乳液的生物學效應[10]。WPI具有環(huán)境敏感性和生物降解性，其作為乳化劑穩(wěn)定的乳液在胃腸環(huán)境下易降解，不利于營養(yǎng)物質(zhì)的遞送體系發(fā)揮最大的生物利用率。有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)-多糖雙層乳液可增強單層納米乳液的理化穩(wěn)定性，對所包埋營養(yǎng)物形成更好的保護，更適用于營養(yǎng)物在人體消化道內(nèi)的釋放和吸收[11-12]。近年來，NA納米乳液的體外消化規(guī)律鮮有報道，對WPI-多糖雙層納米乳液消化規(guī)律的研究也并不多見。

本實驗以WPI為乳化劑構(gòu)建NA納米乳液，并在WPI界面層引入ι-卡拉膠（ι-carrageenan，ι-Car）和阿拉伯膠（gum arabic，GA）制備雙層納米乳液。分析NA單層納米乳液（NA/WPI-e）及加入ι-Car和GA制備的雙層納米乳液（NA/WPI/ι-Car-e、NA/WPI/GA-e）在口腔、胃、腸消化過程中粒徑、Zeta電位的變化，比較體外消化后游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）釋放率以及NA生物利用率的變化規(guī)律，以期為選用WPI等生物大分子乳化劑構(gòu)建納米乳液用于NA等營養(yǎng)物的遞送提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NA（純度≥98%） 武漢科瑞生物技術(shù)公司；WPI（純度≥98%） 美國Davisco食品國際公司；NA標準品、中鏈甘油三酯（medium chain triglyceride，MCT）、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）、GA、ι-Car、黏蛋白、胃蛋白酶、豬膽汁鹽 上海源葉生物科技有限公司；胰酶 美國Aladdin工業(yè)公司；甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、硝酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鉀、檸檬酸鉀、尿素 國藥集團化學試劑有限公司；疊氮鈉天津科密歐試劑有限公司；尼羅紅 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

J-26 XP型高速冷凍離心機 美國Beckman Counter公司；ZetasizerNano ZS90型光散射粒徑分析儀 英國Malvern公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；Ultra-Turrax T18型高速分散器 德國IKA公司；905 Titrando型全自動電位滴定儀 瑞士Metrohm公司；PHS-3C型pH分析儀 上海雷磁公司；M-110-EH-30型高壓微射流納米均質(zhì)機 美國MFIC公司；MA100N型倒置熒光顯微鏡 日本尼康公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 NA納米乳液的制備

NA/WPI-e的制備：稱取10 mg NA（純度98%）溶于10 g MCT中，超聲處理20 min至完全溶解，形成油相。將WPI溶于pH 7.0的0.05 mol/L的PBS中，室溫下攪拌4 h后放置于4 ℃冰箱溶脹過夜，使蛋白質(zhì)充分溶解。水相的WPI質(zhì)量濃度為50 mg/mL。在高速剪切儀的作用下（18 000 r/min、5 min），將NA油相緩慢加入到水相中，形成油體積分數(shù)10%的粗乳液。再通過高壓微射流納米均質(zhì)機進一步處理，在均質(zhì)壓力10 000 psi條件下循環(huán)3 次得到NA/WPI-e。加入0.02%疊氮化鈉，抑制微生物的生長。

NA/WPI/ι-Car-e和NA/WPI/GA-e的制備：在NA/WPI-e的基礎上加入不同質(zhì)量濃度的GA和ι-Car溶液，由高壓微射流納米均質(zhì)機進行二次均質(zhì)，GA和ι-Car在乳液中最終質(zhì)量濃度為1、2、3 mg/mL。

1.3.2 體外模擬消化實驗

參考Li Yan等[13]構(gòu)建的體外消化模型，模擬口腔、胃和腸3 個階段。

口腔模擬消化：稱取3.6 g乳液與1.4 mL PBS（pH 7.0，10 mmol/L）混合，然后與9 mL口腔模擬液（1.594 g/L氯化鈉、0.328 g/L硝酸銨、0.636 g/L磷酸二氫鉀、0.198 g/L尿素、0.202 g/L氯化鉀、0.308 g/L檸檬酸鉀、5 g/L黏蛋白）充分混合，保證混合體系中油的質(zhì)量分數(shù)為2%，調(diào)節(jié)pH 6.8，于37 ℃水浴中攪拌90 s，轉(zhuǎn)速100 r/min。90 s后停止反應，取2 mL用于粒徑、Zeta電位的測定。

胃部模擬消化：經(jīng)口腔消化后的樣品以體積比1∶1與胃模擬液（NaCl 2 g、胃蛋白酶3.2 g、7 mL 37% HCl溶液，溶于1 L水中充分混合后，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 1.2）混合，共計32 mL，保證混合物中油相的質(zhì)量分數(shù)為1%，然后調(diào)節(jié)pH 2.5，于37 ℃水浴中攪拌1 h，轉(zhuǎn)速100 r/min。隨后停止酶促反應，取2 mL用于后續(xù)粒徑、Zeta電位的測定，剩余溶液進行腸消化。

小腸模擬消化：消化液樣品在經(jīng)過模擬胃消化階段1 h后，調(diào)節(jié)pH 7.0，并依次加入3.5 mL膽鹽溶液（5 mg/mL）、1.5 mL CaCl2（5 mmol/L）與NaCl（150 mmol/L）混合溶液，再調(diào)節(jié)其pH 7.0；最后加入2.5 mL現(xiàn)配制的胰酶（1.6 mg/mL）懸浮液，開始小腸油脂消化，消化2 h。在腸消化過程中，使用pH-stat法將0.25 mol/L的NaOH溶液加入消化體系使pH值控制在7.0左右，并記錄消耗NaOH溶液的體積。消化結(jié)束后冰浴10 min停止酶促反應，隨后測定粒徑、Zeta電位。

1.3.3 FFAs釋放率的測定

在腸消化過程中，脂肪在胰脂肪酶的作用下不斷被水解為FFAs。根據(jù)2 h內(nèi)NaOH溶液消耗量計算出體系中FFAs釋放量，如式（1）所示：

式中：Vexp（NaOH）為滴定時消耗NaOH溶液的體積/L；C（NaOH）為實驗所用NaOH溶液濃度（0.25 mol/L）；m（MCT）為消化前樣品中MCT質(zhì)量/g；mW（MCT）為MCT的摩爾質(zhì)量（500 g/mol）。

1.3.4 NA納米乳液生物利用率的測定

NA標準曲線的繪制：采用HPLC方法，色譜條件參考Zhang Ping等[14]的方法。精密稱取NA 1.0 mg，用甲醇進行梯度稀釋。以標準品溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸所得的回歸方程為：y=23 669x＋4 839.6（R2=0.999 1）。表明NA在0.25～10.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

NA質(zhì)量濃度的測定：采用HPLC方法。準確吸取200 μL的樣品，然后依次加入2 mL的甲醇和2 mL的正己烷的混合有機相進行萃取。4 000 r/min離心6 min后，除去上清正己烷，取1 mL樣品12 000×g離心2 min后，過有機膜后進行HPLC分析。利用測得的標準曲線回歸方程計算NA的質(zhì)量濃度。

生物利用率的測定參照Qian Cheng等[15]的方法。NA納米乳化體系經(jīng)模擬腸階段消化后，消化液10 000 r/min離心35 min后得到膠束液。取中間的膠束液，利用NA標準曲線計算質(zhì)量濃度。根據(jù)式（2）計算消化后NA的生物利用率：

式 中 ：C膠束為 消 化 后 膠 束中NA的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；C消化前為消化前NA的質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.5 NA納米乳液平均粒徑、Zeta電位的測定

參考劉蕾等[16]的方法。利用馬爾文激光粒徑儀在25 ℃測量NA納米乳液的平均粒徑及Zeta電位。樣品用PBS稀釋500 倍，以防止多次散射效應。設定測量參數(shù)為：樣品折射率為1.473；分散劑折射率為1.330。

1.3.6 熒光顯微鏡觀察

采用倒置熒光顯微鏡分析乳液體外模擬消化后形態(tài)的變化。取一定量的消化樣品，滴加質(zhì)量分數(shù)0.02%的尼羅紅熒光染料，搖勻，避光。取少量樣品滴于載玻片上，輕輕壓上蓋玻片并避免氣泡產(chǎn)生。用熒光顯微鏡觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗均重復3 次，采用SPSS 20進行顯著性分析，使用Origin 8.0軟件進行繪圖。P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 NA納米乳液體系在體外消化過程中粒徑的變化

如圖1所示，NA/WPI-e和NA/WPI/ι-Car-e、NA/WPI/GA-e經(jīng)過口腔消化后的粒徑和原始乳液相比無顯著變化（P＞0.05），表明乳液在口腔消化過程中保持穩(wěn)定。模擬胃液消化后，NA/WPI-e和NA/WPI/ι-Car-e、NA/WPI/GA-e的粒徑均顯著增大（P＜0.05）。NA/WPI/ι-Car-e、NA/WPI/GA-e經(jīng)模擬小腸消化后的平均粒徑均低于NA/WPI-e的平均粒徑。GA質(zhì)量濃度為2 mg/mL和3 mg/mL的雙層納米乳液經(jīng)過腸液模擬消化后，納米乳液的平均粒徑均顯著低于胃消化后的粒徑（P＜0.05），此時GA基本上全部從WPI形成的膜層上脫落下來。ι-Car在1 mg/mL和3 mg/mL質(zhì)量濃度時小腸消化后的平均粒徑高于胃消化的粒徑，推測由于在小腸模擬消化過程中，脂肪酶、膽鹽和FFAs等與乳液發(fā)生復雜的生物學變化[17]，油脂的消化產(chǎn)物在腸道消化階段形成一系列復合膠體，從而導致乳液的粒徑顯著增大[18]。由圖1可以看出，不同質(zhì)量濃度ι-Car和GA構(gòu)建的NA納米乳液在模擬消化過程中平均粒徑的差別較大。

圖1 不同質(zhì)量濃度ι-Car和GA構(gòu)建的NA納米乳液在模擬消化過程中平均粒徑的變化Fig.1 Change in average particle size of nanoemulsions prepared with different concentrations of ι-Car and GA during simulated digestion

2.2 NA納米乳液在體外模擬消化過程中Zeta電位的變化

圖2 不同NA納米乳液在模擬消化過程中電位的變化Fig.2 Change in zeta potential of different naringin-loaded nanoemulsions during simulated digestion

由圖2可知，NA/WPI-e和NA/WPI/GA-e經(jīng)口腔消化后，乳液所帶的負電荷值均高于原始乳液，部分NA/WPI/ι-Car-e所帶的負電荷降低。NA/WPI-e經(jīng)口腔消化后的Zeta電位為－39.0 mV，經(jīng)模擬胃和小腸消化后乳液所帶的負電荷逐漸減少，Zeta電位分別為－33.5 mV和－22.8 mV。在胃消化的環(huán)境中，NA/WPI/ι-Car-e和NA/WPI/GA-e的多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL和2 mg/mL時，Zeta電位絕對值均高于原始乳液。目前并不完全清楚引起胃消化液中乳液所帶的負電荷增多的物質(zhì)的性質(zhì)。有研究表明，Zeta電位可表示液滴的靜電排斥力，其絕對值越高，乳液的穩(wěn)定性越好。在模擬人體消化的過程中，由于能量壁壘效應的影響，乳液表面的高電荷會阻止消化液破壞乳液內(nèi)部從而保護NA[19]，由于模擬胃消化階段的3 種納米乳液均具有較強的負電荷，對胃蛋白酶的水解具有一定的抵抗作用，有利于NA能順利地被運載至腸道。經(jīng)模擬小腸消化后，NA納米乳液的Zeta電位絕對值均降低。

2.3 NA納米乳液在體外消化過程中顯微鏡觀測

為研究整個口服消化過程中乳液的變化情況，對口腔、胃、小腸中乳液的微觀結(jié)構(gòu)進行觀察，并使用尼羅紅染色法觀察油脂變化情況。圖3部分樣品由于液滴的尺寸太小，已經(jīng)接近熒光顯微鏡的最低分辨率，因此難以很好地觀察，在熒光觀察的視野中顯示一片紅色[20]。

圖3 不同納米乳液消化前后的熒光顯微鏡圖片F(xiàn)ig.3 Fluorescent microscopy images of different nanoemulsions before and after simulated gastrointestinal digestion

由圖3可知，制備的納米乳液在不同消化階段發(fā)生了不同程度的水解。由于乳液在口腔中消化時間僅為90 s，而NA/WPI/ι-Car-e顯示出絮凝狀，且ι-Car質(zhì)量濃度越高，聚集液滴越多，推測其在口腔消化后的聚集可能與ι-Car空缺絮凝作用有關(guān)[21]。由圖3可知，當乳液完成胃消化階段后，乳液液滴明顯聚集，在小腸中，乳液體系發(fā)生解絮凝。Lim等[22]研究也發(fā)現(xiàn)WPI和GA制備的雙層乳液在小腸消化中存在解絮凝現(xiàn)象。結(jié)合消化過程中NA納米乳液的粒徑與Zeta電位的結(jié)果，NA/WPI-e和雙層納米乳液在胃消化環(huán)境下絮凝，而胃消化階段乳液所帶的負電荷量依舊較高，維持較高的靜電排斥力，隨后在小腸中膽鹽與胰酶的共同作用下，乳液中的油脂消化水解，NA從油脂中逐漸釋放出來，從而有利于NA在腸道中的消化吸收。這與高健[23]的研究結(jié)果相似。Mcclements等[24]的研究也表明，WPI結(jié)構(gòu)中的β-乳球蛋白對胃蛋白酶表現(xiàn)出一定的抗性，且乳白蛋白在胃部消化過程中的酶解也存在降低現(xiàn)象[25]。另外，由于本研究所用的WPI質(zhì)量濃度較高，保證分散相表面覆蓋了致密的蛋白質(zhì)分子層，阻止了蛋白在乳液界面的有效伸展，導致乳化體系的多肽鏈伸展度較小，阻礙了胃蛋白酶對WPI的水解能力[26]，因此NA/WPI-e及NA/WPI/ι-Car-e和NA/WPI/GA-e對胃蛋白酶的水解具有一定的抗性。

2.4 NA納米乳液在體外消化過程中FFAs釋放率的變化

FFAs釋放率是判定NA生物利用率高低的重要參數(shù)。采用pH-stat方法測定模擬小腸消化過程中的FFAs釋放率，其中對照組是溶有同等質(zhì)量濃度NA的MCT油相，結(jié)果見圖4。

圖4 FFAs釋放率在小腸消化中隨消化時間的變化Fig.4 Change in FFA release rate during intestinal digestion

由圖4可知，NA/WPI-e、NA/WPI/ι-Car-e與NA/WPI/GA-e的FFAs釋放率的變化趨勢保持一致，均呈先快速增加后緩慢提高的變化趨勢，在前500 s內(nèi)，3 種納米乳液的FFAs釋放量均快速增加，表明乳液中油脂的水解速度在前500 s都很快，隨后FFAs釋放速率明顯放緩，最后趨于相對穩(wěn)定。NA/WPI-e在腸消化后的最終FFAs釋放率最高為97.3%，NA/WPI/ι-Car-e的FFAs釋放率隨ι-Car質(zhì)量濃度由小到大依次達到94.8%、84.7%和91.5%，NA/WPI/GA-e的FFAs釋放率由小到大依次為96.8%、80.8%和79.3%，對照組FFAs釋放率僅為34%，顯著低于NA納米乳液。由于乳液中油脂的消化水解屬于界面反應[27]，而納米乳液遞送體系的比表面積較大，提高了油脂與胃腸道分泌物的接觸比面積，促進了油脂與吸附的消化酶之間的相互作用[28]，因此表現(xiàn)出更高的油脂水解速率。與陳翰[29]的研究結(jié)果一致。由最終值可以看出在120 min時，乳液體系的FFAs釋放率并未達到100%，這是由于乳液的消化速率越快，顆粒的聚集也越快，使得油滴總的表面積減少，導致FFAs釋放量降低[30]。由圖4可以得出，納米乳液遞送體系能有效地提升油脂的消化速率。

2.5 NA在納米乳液中的生物利用率分析

有研究表明納米乳液遞送體系在模擬小腸消化階段，油脂在脂肪酶與膽鹽的作用下發(fā)生水解，被包埋的營養(yǎng)物逐漸從油脂中釋放出來，被包埋的營養(yǎng)物不斷地載入膠束中，從而被小腸上皮細胞吸收利用[31]。因此，可以利用腸道消化過程后膠束中NA質(zhì)量濃度表示其生物利用率，結(jié)果見圖5。

圖5 NA在納米乳液中的生物利用率Fig.5 Bioavailability of narigine incorporated in different nanoemulsion systems

通過HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，僅溶于油相MCT中的NA在283 nm波長處無峰，說明對照組中NA生物利用率極低。由圖5可知，對比僅溶于MCT中的NA，納米乳液的形成可測得NA的生物利用率。NA/WPI-e經(jīng)過胃腸消化后的生物利用率達10.06%，NA/WPI/GA-e在GA質(zhì)量濃度為1 mg/mL時生物利用率最高為12.13%。NA/WPI/ι-Car-e的NA生物利用率均略低于NA/WPI-e，Mcclements等[32]的研究表明，納米乳液遞送體系中功能物質(zhì)的吸收率顯著高于僅溶解于水中或者油相中的吸收率，與本研究結(jié)果一致。同時，由于納米乳液的表面積體積比很大，其巨大的反應界面面積可以大大增強酶促反應的速率[33]，從而FFAs釋放率和釋放量也隨之增加。由于乳液脂肪水解的程度關(guān)系到小腸消化中膠束的形成，F(xiàn)FAs釋放率越高，脂肪水解程度越高，膠束越易形成，及油脂消化程度與生物利用率呈正相關(guān)[34]，結(jié)合圖4中NA納米乳化體系的FFAs釋放率的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)NA的生物利用率與FFAs釋放率呈正比。與徐麗青[35]、Yi Jiang等[36]的研究結(jié)果類似。部分雙層納米乳液的生物利用率和FFAs釋放率均略低于NA/WPI-e，可能是由于ι-Car和GA的在消化過程中阻礙乳液與消化液的接觸。

3 結(jié) 論

本實驗通過測定粒徑、Zeta電位、FFAs釋放率以及NA生物利用率探討NA單層與雙層納米乳液在口腔、胃、腸中的消化特性。在口腔消化階段，單層及雙層納米乳液的粒徑無顯著變化；在胃消化階段，NA/WPI-e、大部分NA/WPI/GA-e和NA/WPI/ι-Car-e的Zeta電位絕對值高于原始乳液，倒置熒光顯微鏡觀察顯示液滴產(chǎn)生明顯的聚集；在小腸消化階段，NA/WPI-e的粒徑顯著增加，NA/WPI-e及NA/WPI/ι-Car-e、NA/WPI/GA-e的Zeta電位絕對值降低，且顯微鏡觀察顯示納米乳液體系的液滴均發(fā)生一定程度的解絮凝。3 種NA納米乳液的FFAs釋放率和NA利用率明顯高于對照組，且GA質(zhì)量濃度為1 mg/mL的NA/WPI/GA-e相比于NA/WPI-e NA生物利用率更高，因此，NA納米乳液遞送體系能有效提高NA生物利用率，合適的WPI-多糖雙層納米乳液可促進NA的吸收。