張倩 楊旭 王媛 王世軍 王花欣*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355 2.山東省中醫(yī)經(jīng)典名方協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250355

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一類以骨組織微結(jié)構(gòu)破損、骨密度降低、易骨折為特征的代謝性疾病[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)在50歲以上的人群中發(fā)病率約為30 %[2]，引發(fā)的骨折及并發(fā)癥嚴(yán)重影響著中老年人的身心健康，為家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)[3]，成為目前面臨的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。

PMOP的發(fā)病主因是雌激素缺乏，因此臨床常采用雌激素替代療法，但長(zhǎng)期使用會(huì)增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[4]。中醫(yī)治病求本，以“整體觀念，辨證論治”為優(yōu)勢(shì)，注重機(jī)體的陰陽(yáng)平衡，關(guān)注疾病的發(fā)生發(fā)展及變化。此外，中藥資源豐富、藥效理想、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢(shì)也為中醫(yī)藥治療PMOP提供了廣闊的市場(chǎng)[5]。金匱腎氣丸由干地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮、附子、桂枝組成，具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)，化氣行水之功效，現(xiàn)臨床主要用于治療腎陽(yáng)虛相關(guān)病癥[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)給予PMOP女性金匱腎氣丸治療可有效提高骨密度[8]，但具體機(jī)制未明。

本實(shí)驗(yàn)采用卵巢切除法(OVX)復(fù)制PMOP模型，觀察金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠體重、子宮形態(tài)、血脂血糖、鈣磷、骨密度及骨微結(jié)構(gòu)的改善情況，并檢測(cè)金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠血清ALP、IL-6及OPG的影響，以探討其用于PMOP的療效機(jī)制，為指導(dǎo)臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：9月齡SPF級(jí)SD大鼠40只，體重250～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006]。大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，濕度46%左右，溫度24 ℃左右。

1.1.2藥物及試劑：金匱腎氣丸由干地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮、附子、桂枝組成(藥材購(gòu)于山東中醫(yī)藥大學(xué)新中魯醫(yī)院，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為合格產(chǎn)品)；戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂(lè)，1 mg/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號(hào)217180501)；4 %多聚甲醛固定液(Biosharp，批號(hào)BL539 A)；ALP試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)A059-2)；IL-6、OPG ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)E-EL-R0015c；E-EL-R0050c)。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器：小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)(美國(guó)Matrx公司)；高速冷凍離心機(jī)(中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；全自動(dòng)生化分析儀(桂林優(yōu)利特電子集團(tuán)有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；離活體一體化Micro-CT設(shè)備(NEMO，平生醫(yī)療科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1藥物制備：據(jù)《金匱要略》原文記載腎氣丸的藥物用量為干地黃八兩，薯蕷(山藥)、山茱萸各四兩，澤瀉、茯苓、牡丹皮各三兩，桂枝、附子各一兩。方中各藥物用量比例為8∶4∶4∶3∶3∶3∶1∶1，加適量水煎，取藥液冷藏備用。

1.2.2分組與造模：按照隨機(jī)數(shù)字表的方法將大鼠分為2組：假手術(shù)組8只，手術(shù)組32只。手術(shù)組采用OVX復(fù)制OP模型，假手術(shù)組只切除卵巢附近等量脂肪。術(shù)后3 d肌肉注射青霉素，防止感染。術(shù)后7 d，將手術(shù)組大鼠隨機(jī)分為4組：模型組、金匱腎氣丸高劑量組、低劑量組、雌二醇組，每組8只。

1.2.3給藥方式及取材：將中藥飲片水煎兩次后，混合濾液并濃縮至0.85 g(生藥)/mL(相當(dāng)于臨床等效劑量)為低劑量，濃縮至1.7 g(生藥)/mL(相當(dāng)于臨床兩倍用量)為高劑量。雌二醇片制成濃度為0.01 mg/mL(相當(dāng)于臨床等效劑量)的混懸液。灌胃量均為1 mL/100 g大鼠體重，連續(xù)給藥3個(gè)月。10 %水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，取子宮及右側(cè)股骨。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

大鼠去卵巢后每周稱重，取材后稱取子宮重量，計(jì)算子宮系數(shù)。取大鼠子宮置于4 %多聚甲醛中固定，石蠟包埋，組織切片，行HE染色，鏡下觀察子宮組織形態(tài)學(xué)改變。

將大鼠麻醉，取腹主動(dòng)脈血，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中血脂、血糖、鈣、磷的含量，按照試劑盒操作步驟檢測(cè)血清中ALP、IL-6、OPG的含量。

取大鼠股骨，利用Micro-CT進(jìn)行掃描，測(cè)定股骨近端骨密度。利用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行骨組織形態(tài)學(xué)計(jì)量分析，包括骨體積密度(BV/TV)、骨表面積和骨體積的比例(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、結(jié)構(gòu)模型參數(shù)(SMI)、CT均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠子宮重量的影響

與假手術(shù)組相比，模型組體重增長(zhǎng)量最高(P<0.01)，子宮系數(shù)最低，而各用藥組有效的降低了由OVX導(dǎo)致的體重上升，子宮系數(shù)有所上升，見(jiàn)表1。

表1 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠體重及子宮重量的影響

2.2 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠子宮形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠宮腔充盈，子宮完整，子宮內(nèi)膜厚度適中，層次分明，子宮內(nèi)膜上皮柱狀細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整，腺體數(shù)量多。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠子宮宮腔干癟變形且內(nèi)膜厚度明顯變薄，上皮柱狀細(xì)胞胞質(zhì)減少，腺體萎縮減少，體積明顯萎縮，血管稀少。與模型組相比，金匱腎氣丸組與雌二醇組子宮較為完整，血管較為豐富，宮腔萎縮情況略有改善，腺體數(shù)量較模型組多，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠子宮腔形態(tài)的影響(HE，50×)Fig.1 Effect of Jinkui Shenqi Pill on uterine cavity morphology of ovariectomized rats(HE，50×)

圖2 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠子宮內(nèi)膜及腺體的影響(HE，200×)Fig.2 Effect of Jinkui Shenqi Pill on uterus and gland in the ovariectomy rats(HE，200×)

2.3 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠骨密度及骨微結(jié)構(gòu)的影響

用藥3個(gè)月后，與假手術(shù)組相比，模型組骨密度明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，金匱腎氣丸低劑量組骨密度明顯上升(P<0.05)，見(jiàn)表2。股骨三維成像圖可見(jiàn)，假手術(shù)組大鼠骨小梁大小、粗細(xì)適中、排列整齊、骨連接度好；模型組大鼠股骨骨小梁變短變薄、稀疏、斷裂，明顯呈骨質(zhì)疏松狀；給予金匱腎氣丸治療后，骨微結(jié)構(gòu)明顯改善，骨小梁結(jié)構(gòu)完整，見(jiàn)圖3、表3。

圖3 金匱腎氣丸對(duì)去卵巢大鼠骨密度的影響(三維成像圖)Fig.3 Effect of Jinkui Shenqi pill on bone mineral density in the ovariectomy rats

表2 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠骨密度的影響

2.4 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠血脂和血糖的影響

大鼠去卵巢后，由于雌激素減少，導(dǎo)致體重上升，肥胖又進(jìn)一步影響了血糖和血脂的正常值。與假手術(shù)組相比，模型組的血糖、TG、CHOL顯著上升，相比于模型組，金匱腎氣丸高、低劑量組大鼠血糖血脂明顯下降，見(jiàn)表4。

表3 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effect of Jinkui Shenqi Pill on bone microstructure in the ovariectomy

表4 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠血脂和血糖的影響

2.5 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠血清中鈣、磷的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中的鈣、磷水平明顯下降；而金匱腎氣丸高劑量組較模型組的表達(dá)顯著升高，見(jiàn)表5。

表5 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠血清中鈣、磷的影響

2.6 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠血清中ALP、IL-6及OPG的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中ALP、IL-6含量明顯升高，OPG含量明顯降低；與模型組相比，金匱腎氣丸高、低劑量組與雌二醇組都有效的降低了血清中ALP、IL-6含量，提高了OPG含量，見(jiàn)表6。

表6 金匱腎氣丸對(duì)OVX大鼠血清中ALP、IL-6及OPG的影響

3 討論

中老年人多為陽(yáng)虛體質(zhì)，常出現(xiàn)腰膝酸軟、怕冷、耳鳴、五更泄瀉等癥狀。腎陽(yáng)為全身陽(yáng)氣之根本，腎陽(yáng)虛衰，骨骼得不到正常的氣血充養(yǎng)，關(guān)節(jié)無(wú)法發(fā)揮其正常的屈伸、支持等功能，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松。金匱腎氣丸出自《金匱要略》，被譽(yù)為“千古補(bǔ)腎陽(yáng)第一方”。方中諸藥合用，使腎陽(yáng)振奮，氣化復(fù)常，使腎陽(yáng)得補(bǔ)，血脈暢通，筋脈、骨骼得養(yǎng)[9]。研究發(fā)現(xiàn)金匱腎氣丸可緩解跟骨骨質(zhì)增生帶來(lái)的疼痛，有效治療“骨痿”[10]。臨床對(duì)100例OP患者在治療基礎(chǔ)上加服金匱腎氣丸后發(fā)現(xiàn)觀察組骨密度明顯高于對(duì)照組[11]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，山茱萸新苷Ⅰ具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化的作用，能顯著升高成骨細(xì)胞Wnt2、BMP2、β-catenin、OPG和NOX4的mRNA表達(dá)水平[12]。另實(shí)驗(yàn)表明，干地黃能顯著抑制OVX對(duì)大鼠股骨和腰椎的影響[13]。

絕經(jīng)后卵巢功能衰退，雌激素驟降引起體內(nèi)脂肪代謝的紊亂，出現(xiàn)食欲亢進(jìn)及活動(dòng)減少，使基礎(chǔ)代謝率降低，體內(nèi)脂肪含量增加而導(dǎo)致肥胖[14]。脂肪細(xì)胞過(guò)度分化降低成骨細(xì)胞分化和骨形成，使骨形成小于骨吸收，從而引起骨礦物質(zhì)含量減少，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[15]。而鈣、磷的變化是反映全身骨質(zhì)代謝情況的重要指標(biāo)[16]。實(shí)驗(yàn)表明，OVX大鼠體重明顯上升，并且出現(xiàn)血糖及血脂的升高，鈣磷水平下降，金匱腎氣丸與雌二醇都有效地降低了由雌激素缺乏導(dǎo)致的肥胖及血糖血脂的異常，提高了血清鈣磷水平。

ALP是一種存在于成骨細(xì)胞中的胞內(nèi)酶，其活性與骨形成密切相關(guān)，因此ALP是反映骨形成的重要標(biāo)志[17]。骨代謝旺盛時(shí)成骨細(xì)胞活躍，血清中ALP活性增強(qiáng)，OVX大鼠雌激素分泌減少，使骨呈現(xiàn)高代謝狀態(tài)，即高骨形成和高骨吸收，同時(shí)骨形成小于骨吸收，造成大量骨質(zhì)的丟失，這和絕經(jīng)婦女的骨代謝情況相符合[18]。OPG由成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，能抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)的分化和成熟，因此，血清OPG水平在骨質(zhì)疏松早期診斷中有重要意義[19]，IL-6作為免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞因子，可直接激活破骨細(xì)胞活性，導(dǎo)致骨吸收活動(dòng)增強(qiáng)，促進(jìn)了骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展[20]。雌激素作為主要抑制破骨細(xì)胞活性的激素之一，OVX大鼠體內(nèi)雌激素含量下降，則破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，血清中IL-6水平提高[21]。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金匱腎氣丸通過(guò)影響ALP、IL-6及OPG的表達(dá)抑制破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨形成，改善骨組織微結(jié)構(gòu)，提高骨密度，以改善骨質(zhì)疏松，具有良好的臨床推廣價(jià)值。金匱腎氣丸作為中藥復(fù)方制劑兼具溫補(bǔ)腎陽(yáng)的作用，但后續(xù)還需進(jìn)一步深入研究探討其調(diào)控機(jī)制，為金匱腎氣丸的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。