常培學(xué) 李海波 方其超 許振培 符茂雄

1. ?？谑械谒娜嗣襻t(yī)院老年病科、內(nèi)分泌科，海南 海口 571100 2. ?？谑械谒娜嗣襻t(yī)院腎內(nèi)科血透室，海南 ?？?571100 3. 海南醫(yī)學(xué)院附屬第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，海南 ?？?570311

近年來(lái)，由于不合理的生活方式，飲食習(xí)慣和社會(huì)老齡化，糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)病率迅速增加。據(jù)預(yù)測(cè)，到2045年全球糖尿病患病人數(shù)將增加到6.29億[1]。糖尿病已成為另一個(gè)全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。骨量流失是糖尿病的并發(fā)癥之一，它是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥之一，其特征是鈣磷代謝紊亂，BMD下降和骨微觀(guān)結(jié)構(gòu)變化[2]。鋅作為一種必需的微量元素，在人體中起著重要的生理作用。鋅也是胰島素的一種成分，它調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞分泌胰島素并穩(wěn)定血糖，因此據(jù)報(bào)道鋅對(duì)糖尿病大鼠有降血糖作用[3]。許多研究發(fā)現(xiàn)鋅對(duì)去卵巢大鼠有骨保護(hù)作用[4]。值得注意的是，異補(bǔ)骨脂素是從多種水果，蔬菜和傳統(tǒng)中藥中分離得到的，對(duì)卵巢切除術(shù)引起的骨質(zhì)疏松具有保護(hù)作用[5]。此外，異補(bǔ)骨脂素通過(guò)增加小梁骨微觀(guān)結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度以及對(duì)骨形成的刺激作用[6]，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化[7]。然而，鋅聯(lián)合異補(bǔ)骨脂素是否有益于保護(hù)糖尿病患者骨量還沒(méi)有報(bào)道。因此，在本研究中，我們通過(guò)注射鏈脲佐菌素建立1型糖尿病大鼠模型，并通過(guò)補(bǔ)鋅和異補(bǔ)骨脂素來(lái)觀(guān)察其對(duì)糖尿病大鼠骨量的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究方案

50只12周齡體重為230～260雌性SD大鼠用于本研究中；所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，其中40只大鼠均腹腔一次性注射鏈脲佐菌素(STZ)(劑量60 mg/kg)構(gòu)建1型糖尿病模型。STZ在pH為4.5的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中溶解；劑量是基于先前報(bào)道的劑量[8]。對(duì)照組10只大鼠注射檸檬酸緩沖液。72 h后，用ACCU-CHEK Advantage血糖儀(Indianapolis Roche Medical Company，IN，USA)測(cè)量血糖以確認(rèn)模型建立成功。隨后將糖尿病大鼠分為以下4組，每組10只，分別為單純對(duì)照組(Con)、鋅治療組(Zn)、異補(bǔ)骨脂素組(Bgz)以及鋅聯(lián)合異補(bǔ)骨脂素組(Zn+Bgz)；鋅治療組、異補(bǔ)骨脂素組以及鋅聯(lián)合異補(bǔ)骨脂素組大鼠分別給予0.25 mg/(kg.d)硫酸鋅灌胃；20 mg/(kg.d)異補(bǔ)骨脂素灌胃給藥或者兩者聯(lián)合給藥治療，連續(xù)12周。

1.2 標(biāo)本獲得及檢測(cè)

為了評(píng)估藥物治療對(duì)大鼠骨量和骨密度的影響，使用Micro-CT在給藥周期結(jié)束時(shí)對(duì)每只大鼠的右側(cè)股骨進(jìn)行掃描。使用Micro-CT掃描儀(SkyScan-1076 in IVIVE CT-scanner；SkyScan，Kontich，比利時(shí))對(duì)股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行具有18 μm的各向同性?huà)呙?每次掃描設(shè)置參數(shù)70 kV、85μA、180°)。使用Micro-CT自帶的軟件(V1.11.0.0；SkyScan)計(jì)算骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)和骨密度(BMD)。

隨后進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，用10%緩沖福爾馬林固定大鼠右股骨24 h，然后用10%乙二胺四乙酸脫鈣14 d。然后用乙醇和二甲苯對(duì)骨頭進(jìn)行脫水處理。石蠟包埋切片后，用蘇木精和伊紅(HE)染色制成4 μm薄的組織學(xué)切片。這些圖像隨后用光學(xué)顯微鏡獲得。

隨后進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)以評(píng)估骨骼強(qiáng)度變化，使用商用力學(xué)測(cè)試系統(tǒng)(Bose Electrforce 3220，Bose Corp，Eden Prairie，MN)，通過(guò)三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)檢查左側(cè)股骨，以評(píng)估整個(gè)骨骼的力學(xué)性能。股骨樣本置于兩個(gè)固定加載點(diǎn)之間跨度為20 mm的下部支架上。上加載板在骨干中點(diǎn)施加2 N的預(yù)緊力固定試件，然后以2 mm/min的恒定位移速率施加載荷直至破壞。同時(shí)繪制了荷載-位移曲線(xiàn)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了自動(dòng)分析。根據(jù)三點(diǎn)彎曲載荷-位移曲線(xiàn)計(jì)算最大載荷、最大剛度和最大破壞能量。

后對(duì)股骨組織進(jìn)行蛋白印跡檢測(cè)，將右側(cè)股骨組織中段在含有液氮的砂漿中用研磨器研磨成粉末狀。用骨組織專(zhuān)用蛋白提取試劑盒(BestBio，中國(guó)上海)分離脛骨標(biāo)本中的蛋白質(zhì)。用10 %的三甘氨酸SDS-PAGE電泳40 g/樣品，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜(EMD微孔，Billerica，MA)。在含5%牛血清白蛋白的TBST(三緩沖液，0.5%吐溫-20)中封閉1 h后，在含5%牛血清白蛋白的TBST中與抗 p-GSK-3β(ABCAM)、GSK-3β(ABCAM)、β-catenin (ABCAM)和β-actin的一抗孵育過(guò)夜，然后以1∶3 000稀釋。使用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(GE ImageQuant 350，GE Healthcare)可視化蛋白條帶，然后使用QuantityOne軟件(Bio-Rad)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s test比較不同組間的數(shù)據(jù)。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠組織學(xué)變化

HE結(jié)清楚表明，Zn聯(lián)合Bgz治療能更好的保護(hù)1型糖尿病大鼠骨量的流失。如圖1所示，與Con組相比，Zn、Bgz及Zn+Bgz組的大鼠骨小梁數(shù)量和密度得到明顯的改善，而在Zn+Bgz組表現(xiàn)的最為明顯。

圖1 三組大鼠股骨干骺端HE切片檢測(cè)結(jié)果注：A Con組，B Zn組，C Bgz組，D Zn+Bgz組 (20×)。Fig.1 Results of HE slices in the femoral metaphysis of three groups of rats

2.2 Micro-CT檢測(cè)結(jié)果

Micro-CT更好的顯示了骨小梁的總體改變情況，股骨的微觀(guān)參數(shù)如圖2所示。Zn組、Bgz組、Zn+Bgz組左側(cè)股骨干骺端骨小梁BMD、Conn.D、Tb.N、Tb.Th較Con組明顯升高，而Tb.Sp較Con組明顯降低 (P<0.05)；而Zn+Bgz組BMD、Conn.D、Tb.N、Tb.Th較Zn組、Bgz組明顯升高，而Tb.Sp較Zn組、Bgz組明顯降低(P均<0.05)。

圖2 四組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測(cè)結(jié)果注：a Con組，b Zn組，c Bgz組，d Zn+Bgz組；與Con組相比，*P<0.05；與Zn組相比，#P<0.05；與Bgz組相比，&P<0.05。Fig.2 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of four groups of rats

2.3 骨強(qiáng)度改變比較

四組骨生物力學(xué)結(jié)果如圖3所示，和Con組比較，Zn組、Bgz組和Zn+Bgz組左側(cè)股骨最大負(fù)荷、剛度和最大功耗較Con組明顯升高(P<0.05)；而Zn+Bgz組最大負(fù)荷、剛度和最大功耗較Zn組和Bgz組明顯升高 (P均<0.05)。

圖3 各組大鼠股骨最大負(fù)荷(A)、剛度(B)和最大功耗 (C)注：與Con組相比，*P<0.05；與Zn組相比，#P<0.05；與Bgz組相比，&P<0.05。Fig.3 Changes in the maximum femoral load(A), stiffness(B), and energy to failure (C)of rats in each group

2.4 Wnt/β-catenin信號(hào)通路改變

和Con組比較，Zn組、Bgz組和Zn+Bgz組的大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活；Wnt 1、Wnt 5a、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。和Zn組和Bgz組比較，Zn+Bgz組Wnt 1、Wnt 5a、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 使用WB檢測(cè)Wnt 1、Wnt 5a、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin和β-actin的相對(duì)表達(dá)注：與Con組相比，*P<0.05；與Zn組相比，#P<0.05；與Bgz組相比，&P<0.05。Fig.4 Relative expression of Wnt 1、Wnt 5a，p-GSK-3β, GSK-3β, β-catenin to β-actin using Western blotting

3 討論

糖尿病骨質(zhì)疏松癥(DOP)是糖尿病并發(fā)癥之一。胰島素的缺乏會(huì)導(dǎo)致鈣和磷代謝紊亂，從而導(dǎo)致骨密度降低和骨微結(jié)構(gòu)改變[9]。在高血糖環(huán)境中，糖尿病會(huì)影響骨骼代謝和骨骼完整性[10]，抑制成骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，削弱骨形成并抑制骨礦化[11]，因此認(rèn)為高血糖是誘發(fā)糖尿病性骨質(zhì)減少的重要因素[12]。據(jù)報(bào)道鋅對(duì)雌激素缺乏引起的骨質(zhì)流失具有有益作用，據(jù)推測(cè)鋅對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有保護(hù)作用[13]。先前的體內(nèi)和體外研究表明異補(bǔ)骨脂素具有骨保護(hù)作用。例如，向缺乏性激素的小鼠施用異補(bǔ)骨脂素(10和20 mg/kg，持續(xù)8周)后，骨質(zhì)疏松癥狀得到改善，小鼠表現(xiàn)出增強(qiáng)的骨強(qiáng)度和改善的小梁骨微結(jié)構(gòu)[14]。然而，尚未研究鋅聯(lián)合異補(bǔ)骨脂素是否較單獨(dú)使用對(duì)糖尿病大鼠骨骼有益作用更為顯著。在本研究中，結(jié)果表明鋅聯(lián)合異補(bǔ)骨脂素治療12周可以預(yù)防糖尿病大鼠的骨質(zhì)流失，且效果較單獨(dú)使用更為顯著。

在本研究中，在糖尿病大鼠中觀(guān)察到BMD降低，以及骨骼結(jié)構(gòu)破壞，在鋅或者異補(bǔ)骨脂素干預(yù)12周后，這些癥狀明顯改善，骨密度明顯升高，證實(shí)鋅或者異補(bǔ)骨脂素對(duì)糖尿病大鼠骨密度降低具有保護(hù)作用，而鋅聯(lián)合異補(bǔ)骨脂素治療組骨密度改變最為顯著。除了骨密度，骨保護(hù)的另一個(gè)重要評(píng)估指標(biāo)是骨骼的形態(tài)參數(shù)，例如骨量和骨小梁厚度等[15]。本研究發(fā)現(xiàn)1型糖尿病大鼠股骨干骺端的小梁骨破裂，骨小梁變薄，骨小梁之間的間距變大。鋅治療組、異補(bǔ)骨脂素組以及聯(lián)合治療組大鼠BV/TV、Tb.Th和Tb.N均顯著降低，而Tb.Sp顯著降低；鋅或者異補(bǔ)骨脂素干預(yù)治療后增加了骨小梁的數(shù)量以及之間連接明顯優(yōu)于T1DM組，且聯(lián)合治療組的微觀(guān)參數(shù)最佳。本研究進(jìn)一步觀(guān)察干預(yù)方法對(duì)骨強(qiáng)改變，結(jié)果顯示Zn+Bgz組最大負(fù)荷、剛度和最大功耗明顯優(yōu)于其他組，這表明鋅聯(lián)合異補(bǔ)骨脂素可以顯著保護(hù)T1DM大鼠的骨量和骨強(qiáng)度。

本研究進(jìn)一步觀(guān)察治療對(duì)典型的Wnt配體(Wnt1)的表達(dá)影響，由于該配體激活Wnt/β-catenin途徑來(lái)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的活性[16-17]。 此外，已知非經(jīng)典的Wnt配體(Wnt5a)可以激活非β-caten依賴(lài)性途徑，并參與調(diào)節(jié)骨細(xì)胞活性[18]。我們的發(fā)現(xiàn)表明，單一的Zn或Bgz明顯上調(diào)了大鼠Wnt1的骨骼基因表達(dá)。但是，發(fā)現(xiàn)Zn、Bgz或Zn+Bgz刺激對(duì)Wnt5a表達(dá)產(chǎn)生影響，揭示了非經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的潛在激活。此外，我們還揭示了在Zn+Bgz刺激下大鼠中β-catenin和p-GSK-3β/GSK-3β的蛋白表達(dá)水平更高，這為經(jīng)典Wnt信號(hào)的激活提供了進(jìn)一步的證據(jù)?？偟膩?lái)說(shuō)本研究結(jié)果表明，Zn+Bgz刺激骨合成代謝可能與經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號(hào)激活均有關(guān)。

綜上，鋅及異補(bǔ)骨脂素對(duì)1型糖尿病引起的骨量流失均有改善作用，而兩者聯(lián)合使用時(shí)效果更佳。其保護(hù)機(jī)制與GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路上調(diào)有關(guān)。由于研究樣本數(shù)和模型及研究時(shí)間的限制，后期會(huì)進(jìn)一步研究本組合治療的優(yōu)勢(shì)。