陳麗英 郭遠學 陳洪嬌 袁偉 王玉蕓

海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102

骨質疏松癥是一種在絕經后婦女和老年人中常見的代謝性疾病。這種疾病的特點是無癥狀情況下出現(xiàn)骨量丟失，導致骨折風險明顯增加，嚴重影響患者的生活質量[1-2]。迄今為止，用于預防或治療骨質疏松癥的藥物雖然表現(xiàn)出一定臨床療效，但是一些藥物嚴重的不良反應，包括使用雌激素可增加乳腺癌的風險，以及長期使用雙膦酸鹽藥物引起下頜骨壞死和胃腸道反應限制臨床療效提高[3]。因此，骨質疏松癥的預防和治療所需藥物亟待開發(fā)或者改進。植物雌激素是一類分子結構類似于17-雌二醇的化合物，與雌激素受體結合，發(fā)揮部分雌激素作用。由于植物雌激素可以抑制雌激素信號，因此已成為治療絕經后骨質疏松癥的潛在治療熱點[4]。根據(jù)化學結構，植物雌激素可分為異黃酮和木質素。牛蒡苷元(Arctigenin，AGN)是一種木質素植物雌激素，具有抗炎[5]、抗氧化[6]、抗纖維化[7]和抗腫瘤[8]等功效。鑒于AGN類雌激素特性以及具有抗炎抗氧化作用，我們假設AGN具有抗絕經后骨質疏松癥作用。研究旨在探討AGN對去卵巢大鼠模型抗骨質疏松作用，并揭示其作用的分子機制。

1 材料和方法

1.1 模型建立和藥物治療

3月齡雌性Sprague-Dawley大鼠購買于上海實驗動物中心，并飼養(yǎng)在12 h光暗循環(huán)，溫度控制在(22±2) ℃和濕度控制在50%～60%且可以自由接觸食物和水的環(huán)境中。大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后進行背側雙側去卵巢術(OVX)或假手術(Sham)[9]，并將大鼠在正常條件下飼養(yǎng)。然后將大鼠分成3組，每組10只：Sham組、OVX組、AGN組[OVX大鼠術后第3天開始給予牛蒡苷元40 mg/(kg.d) 治療，牛蒡苷元購于Sigma-St. Louis, MO, USA]。藥物干預治療12周后，過量麻醉藥物處死大鼠，解剖出雙側股骨和收集血液樣本用于檢測。

1.2 血清骨代謝指標檢測

用南京建成生物工程研究所生產的AKP(A059-1)試劑盒測定血清中堿性磷酸酶(AKP，A059-1)?？咕剖崴嵝粤姿崦?b(TRACP，R052-2)檢測采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(R&D Systems Inc.，美國)。所有檢測均按廠家說明書進行。

1.3 Micro-CT檢測

使用SCAN-CO Medical micro-CT(SCANCO Medical AG, Zurich, Switzerland)掃描大鼠左側股骨。使用VG Studio 2.1 V軟件(版本2.6)對股骨進行掃描，并對18 μm(像素)管電壓為80 kV且電流為60μA的X射線進行成像。在180 °的范圍內總共獲取了450個投影。使用基于Feldkamp算法(Sky Scan)的錐束重建軟件重建圖像切片。從生長板末端起近0.3 mm開始，選擇2 mm作為目標區(qū)域。通過使用CT分析儀軟件繪制定制輪廓來提取皮質骨。獲得骨密度(BMD)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁骨體積分數(shù)(BV/TV)、小梁數(shù)(Tb.N)、小梁分離度(Tb.Sp)，來形成Micro-CT的3D渲染圖像。3D參數(shù)基于對具有渲染表面的行進立方體類型模型的分析。

1.4 股骨三點彎曲實驗

對大鼠股骨進行三點彎曲以確定股骨最大負荷和剛度。簡短地說，將左側股骨放在力學測試裝置上。將股骨放在支架的中間位置，以10 mm/min的持續(xù)測試速度加載直到股骨骨折。記錄數(shù)據(jù)，最后進行分析以獲得極限載荷(N)和剛度(N/mm)。

1.5 組織學觀察

右股骨在室溫下于4%中性福爾馬林緩沖液中固定過夜，并在進行組織學分析前用10%EDTA脫鈣28 d。脫鈣骨的石蠟切片厚度為4 μm。進行Masson染色以檢查骨組織結構的變化。

1.6 WB檢測

右側股骨在液氮中粉碎后，用IP裂解緩沖液從骨組織中提取總蛋白。用BCA蛋白試劑盒定量測定蛋白濃度。將蛋白與加載緩沖液混合，在100 ℃煮沸5 min，使其變性。用15 %SDS-PAGE分離50 μg總蛋白，轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉1 h后，將膜分別與一抗：OPG及RANKL在4 ℃孵育過夜，然后與辣根過氧化物偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。用ECL試劑(美國Thermo Scientific)顯影印跡。使用GAPDH進行歸一化。用Image J軟件測量各蛋白條帶的總和密度。

1.7 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差。統(tǒng)計分析用SPSS 22.0軟件進行?；诜讲詈蛅檢驗比較兩個不同組間差異。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 牛蒡苷元治療12周對骨代謝指標的影響

圖1顯示了AGN治療對骨轉換標志物的影響。與Sham組相比，OVX組AKP和TRACP水平顯著升高(P<0.05)。與OVX組相比，AGN組骨代謝指標AKP和TRACP水平顯著降低(P<0.05)。

圖1 AGN治療對骨代謝指標的影響注：和Sham組比較，##P<0.05；和OVX組比較，■■P<0.05。Fig.1 Effect of AGN treatment on the bone metabolism indexes

2.2 Micro-CT分析

股骨干骺端骨小梁三維重建圖像如圖2 A所示。股骨干骺端的微觀參數(shù)如圖2B～F所示。OVX組左側股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th較Sham組明顯降低，而Tb.Sp則明顯升高(P<0.05)。AGN組左側股骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明顯高于OVX組(P<0.05)，而Tb.Sp則明顯低于OVX組(P<0.05)。

圖2 三組大鼠股骨干骺端Micro-CT檢測結果注：a Sham組，b OVX組，c AGN組；和Sham組比較，##P<0.05；和OVX組比較，■■P<0.05。Fig.2 Results of Micro-CT in the femoral metaphysis of three groups of rats

2.3 股骨組織病理學

股骨干骺端骨小梁的Masson染色如圖3所示，Sham組顯示股骨干骺端骨小梁網狀結構正常。OVX組表現(xiàn)為疏松均勻的骨小梁變薄，導致骨小梁間隙變寬。AGN組骨小梁數(shù)量和連接增加明顯，表現(xiàn)出明顯的結構恢復。

圖3 三組股骨的組織病理學注：A Sham組，B OVX組，C AGN組；Masson染色(10×)。Fig.3 Histopathology of femurs from the three groups

2.4 股骨的生物力學變化

股骨三點彎曲試驗表明，Sham組的極限載荷和剛度均高于OVX組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，AGN組的極限載荷和剛度均高于Mod組(P<0.05)，見表1。

表1 三點彎曲試驗結果Table 1 results of three-point bending

2.5 WB分析

和Sham組比較，OVX組OPG表達水平明顯下調，而RANKL表達水平明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，和OVX組比較，AGN組OPG表達水平明顯上調，而RANKL表達水平顯著下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 使用WB檢測OPG、RANKL和GAPDH的相對表達注：和Sham組比較，##P<0.05；和OVX組比較，■■P<0.05。Fig.4 Relative expression of OPG and RANKL to GAPDH use Western blotting

3 討論

本研究使用去卵巢大鼠模型證實了AGN能減少去卵巢大鼠骨量流失，降低骨轉換(AKP和TRACP)水平，提高骨密度和骨強度，提示AGN能改善絕經后骨質疏松癥。AGN存在于一系列用于治療類風濕性關節(jié)炎、炎癥性疾病和感染的藥用植物中[5]。體內和體外研究顯示AGN能抑制破骨細胞分化，這有利于類風濕性關節(jié)炎和骨質疏松癥的治療[10]。有學者進一步研究發(fā)現(xiàn)，通過成骨細胞和骨髓細胞的共培養(yǎng)，AGN顯著抑制破骨細胞樣細胞的形成[11]。本研究證實AGN可減少去卵巢大鼠骨量丟失可能是通過改善骨代謝，從而改善絕經后骨質疏松癥。

眾所周知，雌激素缺乏是原發(fā)性骨質疏松癥(絕經后骨質疏松癥)的主要危險。雙側去卵巢導致子宮濕重、股骨干重、BMD、骨生物力學強度和骨量顯著降低，這些變化是由于雌激素缺乏引起的[12]。在過去的幾十年中，去卵巢大鼠被確認為雌激素缺乏誘導的絕經后骨質疏松癥的有力動物模型[13]。由于去卵巢大鼠骨骼發(fā)育與人類骨骼發(fā)育高度相似，因此被廣泛使用[14]。總之，使用去卵巢大鼠模型可評估AGN在治療原發(fā)性骨質疏松癥中的作用。更重要的是，本研究采用經典的去卵巢模型，可以更全面地驗證分子AGN對絕經后骨質疏松癥作用和機制。

根據(jù)OVX大鼠的骨吸收和骨形成指標改變，本研究表明AGN能顯著降低血清AKP和TRACP的作用，表明成骨細胞和破骨細胞活性均被降低。但是，本研究更加關注藥物在抑制骨吸收方面的功效。為了觀察松質骨的骨表面重塑改變，本研究使用Micro-CT檢測了骨組織形態(tài)學以解釋BMD的變化。BV/TV是評估重要的骨量和骨質疏松嚴重程度的指標。Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th是評估小梁骨和骨吸收的主要微觀結構變化指標。用AGN治療12周可降低因BV/TV、Tb.Th和Tb.N升高以及Tb.Sp.降低引起的骨質流失。該結果表明AGN通過抑制骨吸收改善了小梁骨的微觀結構。與假設一致的是，AGN處理可以顯著改善極限載荷和剛度。

OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)在調節(jié)骨重建中起關鍵作用[15]。RANK是一種位于破骨細胞表面的受體[16]。RANK的配體是OPG和RANKL，它們主要由成骨細胞和骨髓基質細胞合成和分泌[17]。RANKL激活RANK，促進破骨細胞分化和骨吸收。RANKL的誘餌受體OPG阻斷了這種相互作用。藥物阻斷RANKL是治療骨質疏松癥的有效方法，證實了OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的作用。如果配體與OPG結合，阻斷了OPG與RANK的結合，從而減弱了配體對破骨細胞的抑制作用。另一方面，如果配體與RANKL聯(lián)合抑制RANKL和RANK的結合，從而抑制破骨細胞的分化和增殖，則表現(xiàn)為抑制骨吸收。這項研究的結果表明，AGN上調OPG表達同時下調RANKLE表達，調控OPG/RANKL比率來改善骨形成和骨吸收失衡，最終達到防治絕經后骨質疏松癥的療效。

綜上，牛蒡苷元治療對去卵巢大鼠骨量流失起到保護作用，而這種效果可能通過調控OPG/RANKL信號通路來實現(xiàn)的。