鄭鵬驥 陸楊 張象 胡偵明

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 400016

絕經(jīng)后骨質疏松癥是最常見的原發(fā)性骨質疏松癥，其特征是骨質疏松相關脆性骨折的發(fā)病率顯著增加[1]。盡管雌激素缺乏是骨質疏松癥的主要原因，但由于心血管事件和乳房及子宮癌的風險增加限制通過補充雌激素用來治療或預防這類疾病[2]。甲狀旁腺素(PTH)是美國食品和藥物管理局(FDA)批準的唯一臨床試劑，可用于促進骨形成，但是使用期限不能超過2年[2]。目前的骨質疏松癥治療主要是抗骨吸收劑，但可能出現(xiàn)嚴重的不良反應，如骨形成的減弱[3]。因此，有必要尋求具有可長期用于治療絕經(jīng)后骨質疏松癥的藥物。越來越多的研究表明，活性氧(ROS)誘導的氧化應激隨著衰老而增加，這與絕經(jīng)后骨質疏松癥的病理生理學有關[4-5]。過量的ROS可以抑制成骨細胞的分化和增殖、增強破骨細胞的分化，最終導致更多的骨吸收[6]。吡咯喹啉醌(PQQ)是一種氧化還原循環(huán)平面鄰醌，最初被鑒定為甲醇脫氫酶的輔酶[7]。最近，PQQ由于其在自由基清除中的作用而受到越來越多的關注。然而，PQQ對雌激素缺乏引起的骨質疏松癥的保護作用尚不清楚。本研究使用OVX大鼠模型評估了PQQ在抗雌激素缺乏誘導的骨質疏松癥中的作用和潛在機制。

1 材料和方法

1.1 動物和研究設計

30只12周齡(225～260 g)雌性SD大鼠購自上海實驗動物中心，適應性飼養(yǎng)1周后進行試驗。所有實驗期間大鼠均飼養(yǎng)在23 ℃恒溫條件下12 h光暗循環(huán)的房間中，且所有大鼠都可以自由飲水和接受標準的嚙齒動物飲食。大鼠隨機分成3組(每組n=10)，即OVX組、OVX + PQQ組和Sham組；其中OVX組和OVX + PQQ組進行手術切除雙側卵巢，而Sham組進行假手術，具體手術方案參考已發(fā)表的文獻[8]。除OVX+PQQ組外的所有大鼠均飼喂標準大鼠飲食。OVX + PQQ組大鼠在標準大鼠食物中加入4 mg/kg PQQ。藥物治療12周后，麻醉后通過頸脫位對所有大鼠進行安樂死，收集股骨和血液樣本。

1.2 檢測指標

骨密度和骨微觀結構使用微型計算機斷層掃描(Micro-CT)分析，取出右股骨并保存在10 %福爾馬林液體中，隨后進行Micro-CT平掃。使用隨儀器提供的3D Creator軟件(SkyScan)，對二維圖像生成三維渲染。使用軟件自動計算以下3D參數(shù)，包括骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.th)、骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、結構模型指數(shù)(SMI)。

隨后對股骨進行生物力學檢測，在CT測量后，對右股骨進行如前所述的3點彎曲試驗。使用三點彎曲方法在大鼠安樂死后股骨離體標本進行評估機械骨強度。使用MTS 858 Mini Bionix框架進行測試。將每個股骨放置在兩個鈍邊緣上，其邊緣為22 mm。通過骨干中軸上的沖孔圓形凹口連續(xù)施加垂直載荷直至斷裂。位移率設定為1 mm/min。測試后，計算機記錄載荷-位移曲線，從載荷-變形曲線計算極限載荷(N)，能量(J)和剛度(N/mm)。

將股骨于液氮中冷凍并在RIPA緩沖液裂解，然后等份裝載(20 mg蛋白質)，使用SDS-PAGE分離蛋白質。將蛋白質在100 V下轉移至0.2 mm的聚偏二氟乙烯膜上60 min。使用以下一抗：OPG(1∶2 000，Cell Signalling)、RANKL(1∶750，Santa Cruz BT)、FOXO1(1∶500，Santa Cruz BT)和PPARγ(1∶500，Santa Cruz BT)，然后使用合適二抗處理?；瘜W發(fā)光HRP底物檢測抗原抗體復合物，并使用LI-COR C-Digit印跡掃描儀進行可視化，并使用相關的Image Studio 5.2軟件進行光密度分析。

隨后進行組織學檢測，將股骨固定在福爾馬林中并在升序乙醇系列中脫水。隨后，將股骨嵌入甲基丙烯酸甲酯中并切成4 μm切片用于染色。切片用蘇木精-伊紅(HE)染色以評估微結構。用Osteomeasure軟件(OsteoMetrics，Decatur，GA，USA)進行組織形態(tài)學分析。

1.3 生化分析

使用大鼠特異性試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國南京)檢測血清TRACP-5b、I型膠原C-末端交聯(lián)端肽(CTX-I)、總抗氧化活性(T-AOC)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，檢測根據(jù)制造商的說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)使用均數(shù)+標準差表示。采用單因素方差分析進行兩組之間的比較。經(jīng)方差分析后，Bonferroni檢驗確定兩組之間比較差異是否有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。

2 結果

2.1 PQQ對OVX誘導的骨量丟失的影響

手術12周時大鼠的股骨Mciro-CT掃描結果如圖1 A 所示，骨密度和股骨微觀參數(shù)如表1中B～G所示，與Sham組相比， OVX組的股骨骨密度和骨微觀參數(shù)顯著降低(P<0.05)； OVX組的小梁間距顯著增加(P<0.05)，而OVX + PQQ上述指標明顯優(yōu)于OVX組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。骨組織形態(tài)計量學參數(shù)顯示，PQQ對去卵巢大鼠股骨骨量和骨密度有保護作用。

圖1 治療12周大鼠股骨Micro-CT掃描結果注：與Sham組比較，*P <0.05，** P<0.01；與OVX組比較，#P< 0.05，##P<0.01。Fig.1 Micro-CT scans of femur in rats after 12 weeks treatment

2.2 組織學評估

治療12周時，三組大鼠股骨干骺端HE切片如圖2所示；去卵巢12周時，與Sham組相比較， OVX組的股骨干骺端骨小梁的量明顯降低，骨小梁連接較為稀疏；經(jīng)過12周PQQ干預，OVX + PQQ組大鼠股骨干骺端骨小梁數(shù)量明顯增加，且骨小梁連接更為緊密。

圖2 治療 12周大鼠股骨HE切片結果注：A Sham組；B OVX組；C OVX + PQQ組；(10×)。Fig.2 HE tissue section of femur in rats after 12 weeks treatment

2.3 生物力學性能

生物力學測試獲得的數(shù)據(jù)見圖3，Sham組具有最高的極限載荷、能量和剛度；與OVX組比較，OVX + PQQ組極限載荷、能量和剛度明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 治療對大鼠股骨生物力學的影響注：與Sham組比較，*P<0.05，** P<0.01；與OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。Fig.3 Effects of treatment on femur biomechanics

2.4 治療后大鼠血清TRAP-5b、CTX-I、T-AOC、MDA和SOD的影響

與Sham組大鼠相比，OVX大鼠血清CTX-1、TRACP-5b和MDA水平均顯著升高，而T-AOC和SOD活性顯著降低，但這些參數(shù)通過補充PQQ得到改善(P<0.05)。

圖4 治療對大鼠生化指標的影響注：與Sham組比較，*P<0.05，** P< 0.01。與OVX組比較，#P<0.05， ##P<0.01。Fig.4 Effect of treatment on biochemical indicators in rats

2.5 WB結果分析

與Sham組大鼠相比，OVX大鼠RANKL和RANKL/OPG比率均顯著升高，而OPG和FOXO1表達顯著降低；經(jīng)過PQQ干預后RANKL和RANKL/OPG比率均顯著降低，而OPG和FOXO1表達顯著增加(P<0.05)。

圖5 PQQ對OVX大鼠RANKL、OPG、FOXO1、RANKL與OPG的影響注：與Sham組比較，*P<0.05。與OVX組比較，#P< 0.05。Fig.5 The effect of PQQ on RANKL, OPG and FOXO1 and the ratio of RANKL to OPG in OVX rats

3 討論

OVX大鼠模型是絕經(jīng)后骨質疏松癥研究中成熟且廣泛使用的動物模型[9]。在我們目前的研究中，我們使用大鼠模型來評估PQQ對雌激素缺乏誘導的骨質疏松癥的影響。我們證實OVX導致雌激素缺乏誘導的大鼠骨質流失。同時，我們證明PQQ補充可以顯著改善OVX誘導的骨質流失。雖然雌激素缺乏的主要結果是骨吸收增加，但雌激素在細胞水平上影響骨量[10]。本研究中進一步評估了OVX大鼠在補充PQQ后骨轉換等參數(shù)的變化。目前的研究表明，OVX不僅可以誘導破骨細胞骨吸收，還可以減少成骨細胞的骨形成和骨強度。相反，通過補充PQQ，破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成和骨生物力學指標顯著改善。我們的研究結果顯示，PQQ在預防雌激素缺乏引起的骨質疏松癥中起著顯著的作用，它通過抑制破骨細胞骨吸收，刺激成骨細胞骨形成和增強骨強度。

本研究進一步探索補充PQQ來預防雌激素缺乏引起的骨質疏松癥是否與OVX誘導的氧化應激減少有關。最近的研究強烈表明，雌激素缺乏會加速骨骼衰老，并顯著損害抗氧化應激的防御機制[11]。最近的研究表明，雌激素缺乏會導致Bmi1的下調(diào)，從而增加T細胞中ROS，T細胞活化和RANKL的產(chǎn)生，破骨細胞生成和加速骨量丟失；進一步研究發(fā)現(xiàn)雌激素缺乏誘導的氧化應激，小鼠骨組織中抗氧化酶水平和活性降低，成骨和成骨細胞骨形成受損[12]?？寡趸瘎┦褂脤е翺VX小鼠的成骨和成骨細胞骨形成的強烈改善[4]。目前的研究證實，雌激素缺乏可以誘導氧化應激，降低抗氧化酶水平和活性，而PQQ補充可以通過增加OVX小鼠的抗氧化酶水平和活性來減少氧化應激。

成骨細胞可以產(chǎn)生RANKL和OPG，以調(diào)節(jié)破骨細胞的形成和分化。由于OPG抑制破骨細胞生成，而RANKL支持破骨細胞的骨吸收，因此OPG/RANKL的比例是破骨細胞分化和隨后骨吸收的關鍵因素。據(jù)報道，氧化應激對RANKL的反應增加，并作為破骨細胞生成的細胞內(nèi)第二信使，通過RANKL-TRAF6-Rac1氧化酶依賴性途徑介導破骨細胞增殖分化[6]。FOXOs的特征是存在一個稱為叉頭盒的有翼螺旋DNA結合結構域，代表了針對氧化損傷的關鍵細胞防御機制[5]。氧化應激促進FOXOs易位到細胞核內(nèi)，翻譯后修飾包括磷酸化，泛素化和乙?；４萍に厝狈νㄟ^OPG/RANKL信號傳導途徑誘導了骨形成的生化標志物顯著下降以及破骨細胞生成的增強和FOXO1降低。在本研究中，PQQ顯著下調(diào)了RANKL的蛋白質表達，增強成骨細胞中OPG 和FOXO1的水平。本研究結果表明，PQQ不僅可以有效地阻止雌激素缺乏引起的骨質疏松癥，還可以通過防御氧化應激和改善RANKL/OPG比率。

綜上所述，我們目前的研究表明，雌激素缺乏引起的骨量丟失不僅與增加的氧化應激和破骨細胞骨吸收有關，并且與成骨細胞骨形成減少有關。補充PQQ通過抑制氧化應激和改善RANKL/OPG比率，在預防由雌激素缺乏引起的骨質疏松癥中起重要的作用。因此，目前的研究表明，PQQ有預防和治療絕經(jīng)后骨質疏松癥的潛力。