鄭曉明 王康振 鄭煒宏 楊健松 萬(wàn)明 梁華輝

中山市中醫(yī)院，廣東 中山 528400

隨著人口老齡化和人類飲食的變化，近年來(lái)糖尿病的發(fā)病率一直在增加。這種疾病已逐漸成為全球重要的公共衛(wèi)生危害。糖尿病是一種慢性疾病，并與其他慢性全身性疾病相關(guān)。糖尿病的系統(tǒng)性并發(fā)癥包括：視網(wǎng)膜病變、腎病和神經(jīng)病變以及其他血管并發(fā)癥；糖尿病性骨質(zhì)疏松癥也是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一。由于胰島素的絕對(duì)或相對(duì)缺乏、激素失衡或內(nèi)分泌功能障礙引起的，導(dǎo)致鈣、磷代謝紊亂，出現(xiàn)骨密度下降和骨微觀結(jié)構(gòu)的改變。近年來(lái)的研究表明，氧化應(yīng)激是糖尿病誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥的重要機(jī)制之一。研究已經(jīng)表明活性氧(ROS)可以抑制成骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷和凋亡[1-2]。小檗堿(BBR)是從黃連、水仙等草本植物中提純的一種異喹啉生物堿，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎等作用[3]。近期的研究表明小檗堿可以通過(guò)抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)中NF-κB和Akt途徑來(lái)抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成[4]。在成骨細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)小檗堿可以通過(guò)促進(jìn)p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活Runx2來(lái)增加成骨細(xì)胞的分化[5]。鑒于小檗堿的抗氧化作用，因此，本研究的目的探索小檗堿對(duì)糖尿病大鼠BMD和微觀結(jié)構(gòu)影響和可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究方案

60只雌性SD大鼠，約200～230 g；10周齡，由杭州動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(中國(guó)浙江杭州)提供。在動(dòng)物護(hù)理設(shè)施中，我們看到所有的老鼠都單獨(dú)關(guān)在籠子里，所有的老鼠飼養(yǎng)在22 ℃的空調(diào)房間里，濕度適中，12 h∶12 h的光∶暗循環(huán)，并在研究進(jìn)行之前食用標(biāo)準(zhǔn)的大鼠飼料和水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(CG)(n=15)，糖尿病組(DG)(n=15)，糖尿病+50 mg/(kg·d)小檗堿治療組 (BRB-50)(n=15)；和糖尿病+100 mg/(kg·d)小檗堿治療組(BRB-100)(n=15)。本研究采用多次注射鏈脲佐菌素的方法建立2型糖尿病大鼠模型[6]。在STZ給藥后測(cè)定血漿葡萄糖水平(PGLS)，非空腹PGLS高于16.7 mmol/L閾值的大鼠表明2型糖尿病模型成功建立，后所有大鼠均給予相對(duì)應(yīng)的藥物治療12周。待研究結(jié)束時(shí)收集大鼠尿液和血液，隨后過(guò)量麻醉處死大鼠后收集大鼠雙側(cè)股骨，用生理鹽水包裹，然后在-20 ℃保存，直至分析。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

使用顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描(μCT)(Micro CTμ100，SCANCO Medical，瑞士)分析左側(cè)股骨的骨小梁結(jié)構(gòu)。分析股骨遠(yuǎn)端干骺端骨小梁的掃描圖像(14.8 μm/切片或1.48 mm)，從距生長(zhǎng)板50片(740 μm)開(kāi)始，在感興趣體積(VOI)內(nèi)半自動(dòng)繪制輪廓。在曝光時(shí)間為70 kV、200 μA和300 ms時(shí)，掃描股骨以獲得14.8 μm[7]的圖像分辨率。利用重建軟件進(jìn)行圖像切片重建，然后分別進(jìn)行分析。μCT定量參數(shù)包括：骨密度(BMD)、骨小梁體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間距(TB.SP)和結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)。

隨后對(duì)股骨進(jìn)行組織學(xué)檢查，對(duì)股骨脫鈣后進(jìn)行HE染色。先在4 %的對(duì)二甲醛-海德中室溫固定2 d，然后在乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中脫鈣1個(gè)月。然后，將右股骨組織標(biāo)本在一系列分級(jí)乙醇溶液中脫水，包埋于甲基丙烯酸甲酯中，然后切成5 μm厚的切片。最后，使用圖像分析儀在光學(xué)顯微鏡下用千分尺進(jìn)行標(biāo)本的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。

將股骨于液氮中冷凍并在RIPA緩沖液裂解，然后等份裝載(20 mg蛋白質(zhì))，使用SDS-PAGE(4%堆積，12%流動(dòng)凝膠在120 V時(shí)90～110 min)分離蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)在100 V下轉(zhuǎn)移至0.2 mm的聚偏二氟乙烯膜(目錄號(hào)162e0177，Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，赫拉克勒斯，加利福尼亞)上60 min。使用了以下一抗： Runx2(1∶2 000，Cell Signalling)，b-catenin(1∶750，Santa Cruz BT)，Osterix(1∶500，Santa Cruz BT)和PPARγ(1∶500，Santa Cruz BT)，然后使用合適二抗處理。化學(xué)發(fā)光HRP底物檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物，并使用LI-COR C-Digit印跡掃描儀進(jìn)行可視化，并使用相關(guān)的Image Studio 5.2軟件(LI-COR Biosciences，NE，美國(guó))進(jìn)行光密度分析。Ponceau S(Biorad)用于控制總蛋白含量，β-actin作內(nèi)部對(duì)照。

在小檗堿治療12周后，收集每只大鼠24 h的尿液并保存在-20 ℃冰箱中。隨后所有大鼠均處死，在乙醚麻醉下經(jīng)心臟穿刺抽血。在3 000 r/min下離心10 min，從每個(gè)樣品中提取血清，并在-80 ℃下儲(chǔ)存。然后用ELISA(Uscnlife Life Sciences，Inc.)檢測(cè)尿8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)的水平。采用Kakkar法檢測(cè)血清SOD活性[8]，血清過(guò)氧化氫酶活性采用重鉻酸試劑比色法測(cè)定。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶與5,50-二硫雙-2-硝基苯甲酸反應(yīng)后剩余的谷胱甘肽構(gòu)成一種化合物，其最大吸收波長(zhǎng)為412 nm。以二氯-2,4-二硝基苯為底物，用分光度法測(cè)定GST。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有分析均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。組間使用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行；P<0.05表明比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨小梁形態(tài)學(xué)觀察

所有組的大鼠股骨干骺端進(jìn)行HE染色，以進(jìn)一步觀察組織學(xué)變化，如圖1所示。在DG和Brb-50組中，組織學(xué)檢查顯示出大量的骨小梁已經(jīng)消失和少量不規(guī)則排列的骨小梁。而與使用小檗堿處理后的骨小梁相比；骨小梁的數(shù)量和之間的連接在一定程度上得到了改善。

圖1 小檗堿治療12周時(shí)各組大鼠股骨干骺端組織學(xué)變化(HE染色，10×)和Micro-CT三維重建結(jié)果Fig.1 Hematoxylin and eosin staining (magnification 10×) and Micro-CT three-dimensional reconstruction of the femoral metaphysis of rats in each group at 12 weeks of treatment

2.2 股骨干骺端骨小梁微觀參數(shù)比較

Micro-CT三維重建結(jié)果如圖1所示；骨小梁定量結(jié)果如圖2所示；與對(duì)照組大鼠相比，糖尿病組大鼠的Tb.Sp和SMI的顯著升高，而Tb.Th、Tb.N和BV/TV的水平顯著降低(P均<0.05)。在Brb-50組中的發(fā)現(xiàn)與糖尿病大鼠相似結(jié)果。然而，使用100 mg/(kg.d)小檗堿治療后的糖尿病大鼠的骨小梁上述指標(biāo)均表現(xiàn)出顯著改善。使用小檗堿100 mg/(kg.d)處理的糖尿病大鼠的BV/TV、Tb.N和Tb.Th顯著升高；而Tb.Sp和SMI顯著降低。

圖2 小檗堿對(duì)糖尿病大鼠股骨干骺骨微結(jié)構(gòu)和骨密度的影響注：與CG組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與DG組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Fig.2 The effect of berberine on the femoral metaphysis metatarsal bone microstructure and bone mineral density in diabetic rats

2.3 血清學(xué)比較

檢測(cè)尿8-OHdG觀察實(shí)驗(yàn)大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激的改變；尿8-OHdG檢測(cè)結(jié)果顯示，在DG和Brb-50組均表現(xiàn)出顯著增加(P<0.05)。然而，當(dāng)用100 mg/(kg·d)的小檗堿處理后，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)和對(duì)照組比較，血清抗氧化劑活性指標(biāo)SOD、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和GST在糖尿病大鼠中顯著降低(P均<0.05)。小檗堿100 mg/(kg·d)處理后血清抗氧化水平顯著升高，表現(xiàn)為大鼠血清SOD、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和GST活性顯著升高(P均<0.05)。而B(niǎo)rb-50與糖尿病大鼠之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 小檗堿治療12周對(duì)糖尿病大鼠尿8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OhdG)、SOD活性、過(guò)氧化氫酶活性、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性和GST活性的影響注：與CG組相比，#P <0.05，## P <0.01，###P<0.001；與DG組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Fig.3 Effects of berberine treatment on urine 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OhdG), SOD activity, catalase activity, glutathione peroxidase activity and GST activity in diabetic rats for 12 weeks

2.4 蛋白印跡分析

蛋白印跡結(jié)果如圖4所示；與CG組大鼠相比，糖尿病大鼠的Runx2和Osterix的水平顯著降低，而PPARγ的水平顯著升高(P均<0.05)。在Brb-50組中的發(fā)現(xiàn)與糖尿病大鼠相似結(jié)果。然而，使用100 mg/(kg.d)小檗堿治療后的糖尿病大鼠的Runx2和Osterix顯著升高；而PPARγ顯著降低。表明小檗堿治療后骨形成能力顯著增加，而成脂能力明顯降低。

圖4 成骨細(xì)胞標(biāo)記基因(Runx2和Osterix)和脂肪細(xì)胞標(biāo)記基因(PPARγ)的蛋白質(zhì)印跡分析注：* P <0.05，** P <0.01，n=5。Fig.4 Western blot analysis of osteoblast marker genes(Runx2 and Osterix) and adipocytes marker genes (PPARγ)

3 討論

慢性糖尿病是由高血糖引起的代謝疾病，可以引起多種嚴(yán)重的并發(fā)癥。據(jù)報(bào)道，所有類型的糖尿病患者比正常人更容易出現(xiàn)一系列并發(fā)癥，特別是骨質(zhì)疏松癥。患有糖尿病性骨病的人群處于骨折的高風(fēng)險(xiǎn)類別，甚至導(dǎo)致殘疾和死亡[9]。據(jù)報(bào)道，血糖控制不佳的患者骨折風(fēng)險(xiǎn)增加；與具有良好控制血糖水平和非糖尿病患者的患者相比，風(fēng)險(xiǎn)大約高出47 %～62%[7]。由糖尿病引起的骨病在臨床上非常常見(jiàn)，但在骨折發(fā)生之前通常無(wú)癥狀，因此給社會(huì)和個(gè)人帶來(lái)了巨大的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

本研究探討了小檗堿對(duì)糖尿病大鼠骨量的影響；結(jié)果表明經(jīng)過(guò)小檗堿的治療可以修復(fù)糖尿病大鼠骨微結(jié)構(gòu)的破壞。50 mg/(kg.d)劑量的小檗堿對(duì)糖尿病性骨量幾乎沒(méi)有影響，但在100 mg/(kg.d)水平的干預(yù)下，糖尿病大鼠的微結(jié)構(gòu)受損和骨微觀結(jié)構(gòu)破壞大部分被逆轉(zhuǎn)。以前的研究表明，小檗堿不僅可顯著降低尿8-OhdG水平，而且還可上調(diào)大鼠血清抗氧化劑的活性[10]；因此，提示小檗堿可能有助于改善糖尿病大鼠骨量的流失。糖尿病骨病的病理特征包括骨密度下降和骨微結(jié)構(gòu)改變。這些特征主要是由于高血糖和氧化增加的程度，其與糖尿病性骨病的進(jìn)展最相關(guān)。此外，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大鼠受損的β細(xì)胞脫顆粒、變性甚至壞死，導(dǎo)致胰島素分泌減少和血糖濃度增加[11]。小檗堿治療在一定程度上增加了胰島素的表達(dá)以及β細(xì)胞的再生，并發(fā)揮了促胰島素和胰島素致敏作用[12]。小檗堿可以通過(guò)激活各種組織中的AMPK信號(hào)通路降低了血糖水平，包括脂肪和肌肉[13]。研究已經(jīng)表明，血漿葡萄糖水平的變化類似于糖尿病大鼠骨質(zhì)減少發(fā)生率的變化。高葡萄糖水平是糖尿病性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的機(jī)制之一，高血糖具有引發(fā)氧化應(yīng)激增加的能力，導(dǎo)致包括骨細(xì)胞在內(nèi)的大量細(xì)胞類型的細(xì)胞功能障礙[14]。

在我們的研究中，糖尿病大鼠的尿中8-OHdG排泄增加，而血清抗氧化劑的活性顯著下降。然而，在用100 mg/(kg.d)的小檗堿處理后，8-OhdG水平發(fā)生顯著改變。尿8-OHdG水平呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，血清抗氧化劑活性顯著增加。這些結(jié)果表明因此，表明小檗堿具有降低糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激程度的能力。已知Runx2和Osterix在成骨分化過(guò)程中表達(dá)[15]，WB檢測(cè)到Runx2和Osterix的表達(dá)在糖尿病大鼠中顯著降低。這表明糖尿病大鼠骨形成能力降低。PPARγ是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪細(xì)胞基因表達(dá)和分化中發(fā)揮核心作用[15]。PPARγ靶向在脂肪形成中起關(guān)鍵作用，PPARγ靶基因直接參與成脂途徑。研究發(fā)現(xiàn)小檗堿處理后，PPARγ的表達(dá)明顯降低，且呈劑量依賴關(guān)系，及使用100 mg/(kg.d)小檗堿效果更佳。

本研究表明小檗堿能夠部分逆轉(zhuǎn)糖尿病性骨質(zhì)降低。在以100 mg(kg.d)給予小檗堿后，由糖尿病引起的骨量減少改善最為明顯。但是，我們的研究存在一些局限性。具體而言，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄?shù)量相對(duì)較少，因此導(dǎo)致測(cè)量數(shù)據(jù)有限。此外，除了股骨外，我們還沒(méi)有探討髖部、脊柱、手腕或其他骨骼的骨質(zhì)疏松癥。最后也是最重要的限制是我們只依靠micro-CT來(lái)研究骨量，但是沒(méi)有進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試來(lái)測(cè)量骨強(qiáng)度?？傊?，本研究表明小檗堿能夠通過(guò)促進(jìn)成骨、抑制成脂和氧化應(yīng)激來(lái)預(yù)防糖尿病大鼠的骨量丟失。