孫楊 周多奇 高瑋 楊素琴

1.首都經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)體育部，北京 豐臺(tái) 100070 2.安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 安慶 246133 3.首都經(jīng)濟(jì)貿(mào)易大學(xué)校醫(yī)院，北京 豐臺(tái) 100070 4.北京市豐臺(tái)區(qū)新村社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心全科，北京 豐臺(tái) 100070

糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥(diabetes osteoporosis，DOP)是指因各種原因引起胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足導(dǎo)致慢性長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致全身性骨組織顯微結(jié)構(gòu)受損、骨量減少、骨強(qiáng)度下降、骨脆性增加的一種代謝性疾病[1]。骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是糖尿病的主要并發(fā)癥之一[2]。隨著我國(guó)人口老齡化現(xiàn)象加劇，其發(fā)病率呈逐漸增長(zhǎng)流行趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著人們的身體健康和生活質(zhì)量。DOP作為糖尿病的常見(jiàn)復(fù)合性疾病，其發(fā)病率高、致殘率高的臨床特點(diǎn)使其成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)[3]。因此，如何預(yù)防和延緩糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松尤為重要。本研究通過(guò)觀察雙膦酸鹽聯(lián)合降糖藥物對(duì)2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥大鼠BMP-2，TGF-β1，IGF-1表達(dá)的影響，探討其防治DOP的作用機(jī)理，從而為防治DOP提供新思路新方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

阿侖膦酸鈉(福善美，70 mg，默沙東制藥有限公司)，鹽酸二甲雙胍片(格華止，0.5 g，中美上海施貴寶制藥有限公司)，血糖儀購(gòu)于美國(guó)強(qiáng)生公司，2000型糖化血紅蛋白檢測(cè)儀購(gòu)于德國(guó)拜耳公司，雙能X線骨密度儀器購(gòu)于美國(guó)NORLAND公司，MTS-858型電子萬(wàn)能生物力學(xué)材料試驗(yàn)機(jī)購(gòu)于美國(guó)MA公司，胰島素(INS)試劑盒購(gòu)于南京建成生物科技有限公司。兔抗鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)多克隆抗體及生物素山羊抗兔IgG購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：80只SPF級(jí)健康SD大鼠，雌性，2.5月鼠齡，體重為(190～225)g，由首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)條件：室內(nèi)通風(fēng)換氣，室溫(23.0±2.5)℃，相對(duì)濕度55%～70%，自由進(jìn)食和飲水，日光交替照射，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。按隨機(jī)數(shù)字法分為：對(duì)照組、模型組、阿侖膦酸鈉組、二甲雙胍組、聯(lián)合組。對(duì)照組普通飼料常規(guī)飼養(yǎng)，其余4組先給予高脂飼料喂養(yǎng)6 周后改為普通飼料，并均行2型糖尿病性骨質(zhì)疏松癥造模。

1.2.22型糖尿病性骨質(zhì)疏松癥模型：參考張燕等[4]采用STZ造模聯(lián)合雙側(cè)卵巢切除術(shù)構(gòu)建2型糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松模型實(shí)驗(yàn)方法，造模成功評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)血糖≥300 mg/dL(16.7 mmol/L)或空腹血糖≥10 mmol/L；骨密度(BMC)峰值減少≥2.5 SD(標(biāo)準(zhǔn)差)。80只SD大鼠造模成功60只，造模成功率75 %。

1.2.3藥物處理與干預(yù)：參考人與動(dòng)物體表面積等效劑量比值，和《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》(第4版)[5]，換算成大鼠給藥劑量。對(duì)照組和模型組予0.9% NaCl灌胃，阿侖膦酸鈉組：阿侖膦酸鈉灌胃，二甲雙胍組：鹽酸二甲雙胍，灌胃，聯(lián)合組：阿侖膦酸鈉聯(lián)合鹽酸二甲雙胍，灌胃，連續(xù)給藥6周。

1.2.4標(biāo)本取材：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，尾靜脈采血，檢測(cè)血糖指標(biāo)；10 %水合氯醛腹腔注射麻醉后，采用急性大失血法處死大鼠，收集血標(biāo)本，離心，收集血清，于-20 ℃保存。逐層剝離大鼠右股骨，以0.9 % NaCl濕紗布和錫箔紙包裹，液氮凍透，-20 ℃保存?zhèn)溆茫涣砣〔糠止晒? %多聚甲醛固定24 h，15 %乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣14 d，制備石蠟切片，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5糖代謝參數(shù)：采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2hBPG)、糖化血紅蛋白(HbAlc)，采用放射免疫法檢測(cè)空腹胰島素(FINS)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.6檢測(cè)骨組織骨密度和骨生物力學(xué)指標(biāo)：取出右側(cè)股骨，采用LUNAR雙能X線吸收掃描儀檢測(cè)，應(yīng)用軟件分析計(jì)算骨密度值。采用MTS-858型電子萬(wàn)能生物力學(xué)材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲力學(xué)試驗(yàn)，記錄載荷-變形曲線，計(jì)算最大載荷、最大應(yīng)力和剛度。

1.2.7RT-qPCR檢測(cè)骨組織BMP-2、TGF-β1、IGF-1 mRNA表達(dá)：取骨組織50 mg加入1 mL Trizol于液氮下充分研磨，加入氯仿0.2 mL，參照Trizol RNA提取試劑說(shuō)明書提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度，加入反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。加入相應(yīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系(25 μL)，PCR熱循環(huán)儀擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：96 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，45次循環(huán)擴(kuò)增。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，圖像分析軟件分析條帶密度，采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 RT-PCR amplification primer sequence

1.2.8免疫組化檢測(cè)骨組織BMP-2、TGF-β1、IGF-1蛋白表達(dá)：嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，分別加入一抗BMP-2(1∶200)、TGF-β1(1∶200)和IGF-1(1∶200)，二抗生物素化山羊抗兔IgG(1∶200)，光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖片，胞漿被染成棕黃色或棕色為陽(yáng)性。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析，染色結(jié)果采用平均光密度值(IOD)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 糖代謝指標(biāo)

模型組血清FPG、2hBPG、HbAlc、FINS較對(duì)照組均顯著升高(P<0.05)，雙膦酸鹽組、降糖藥組、聯(lián)合組血清FPG、2hBPG、HbAlc、FINS較模型組均顯著降低(P<0.05)，以聯(lián)合組最低。模型組血清FINS較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，雙膦酸鹽組、降糖藥組、聯(lián)合組血清FINS較模型組顯著升高(P<0.05)，以聯(lián)合組最高。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠糖代謝指標(biāo)比較Table 2 Comparison of glucose metabolism indicators in each group rats

2.2 骨組織骨密度和骨生物力學(xué)指標(biāo)

模型組股骨骨密度、最大載荷、最大應(yīng)力和剛度較對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)，雙膦酸鹽組、降糖藥組、聯(lián)合組股骨骨密度、最大載荷、最大應(yīng)力和剛度較模型組均顯著升高(P<0.05)，以聯(lián)合組最高。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠骨組織骨密度和骨生物力學(xué)指標(biāo)比較Table 3 Comparison of bone mineral density and bone biomechanical indexes of bone tissue in each group

2.3 骨組織BMP-2、TGF-β1、IGF-1 mRNA表達(dá)

模型組骨組織BMP-2、TGF-β1、IGF-1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)，雙膦酸鹽組、降糖藥組、聯(lián)合組骨組織BMP-2、TGF-β1、IGF-1 mRNA表達(dá)較模型組均顯著升高(P<0.05)，以聯(lián)合組最高。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠骨組織BMP-2、TGF-β1、IGF-1 mRNA表達(dá)比較Table 4 Comparison of BMP-2, TGF-β1 and IGF-1 mRNA expression in bone tissue of rats in each group

2.4 骨組織BMP-2、TGF-β1、IGF-1蛋白表達(dá)

模型組骨組織BMP-2、TGF-β1、IGF-1蛋白表達(dá)較對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)，雙膦酸鹽組、降糖藥組、聯(lián)合組骨組織BMP-2、TGF-β1、IGF-1蛋白表達(dá)較模型組均顯著升高(P<0.05)，以聯(lián)合組最高。見(jiàn)圖1、圖2、圖3和表5。

圖1 各組大鼠骨組織BMP-2表達(dá)(400×)注：A 對(duì)照組；B 模型組；C 雙膦酸鹽組；D 降糖藥組；E 聯(lián)合組；注：A 對(duì)照組；B 模型組；C 雙膦酸鹽組；D 降糖藥組；E 聯(lián)合組Fig.1 BMP-2 expression in bone tissue of rats in each group (400×)

圖2 各組大鼠骨組織TGF-β1表達(dá)(400×)注：A 對(duì)照組；B 模型組；C 雙膦酸鹽組；D 降糖藥組；E 聯(lián)合組Fig.2 TGF-β1 expression in bone tissue of each group (400×)

圖3 各組大鼠骨組織IGF-1表達(dá)(400×)Fig.3 IGF-1 expression in bone tissue of rats in each group (400×)

表5 各組大鼠骨組織BMP-2、TGF-β1、IGF-1蛋白表達(dá)比較Table 5 Comparison of BMP-2, TGF-β1, IGF-1 protein expression in bone tissue of rats in each group

3 討論

目前DOP的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，除了性別、年齡、遺傳、DM病程、體質(zhì)等基本因素以外，還包括INS不足和(或)敏感性下降、高血糖、血清甲狀旁腺素、骨鈣素、高脂血癥和性激素等因素[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)BMP-2、TGF-β1、IGF-I在DOP發(fā)病機(jī)制中起重要作用[7]。BMP-2被認(rèn)為是最強(qiáng)的骨誘導(dǎo)分化因子，能夠誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞分化為成熟軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和成骨因子的表達(dá)[8-9]。TGF-β1屬于TGF-β超家族成員之一，不僅可促進(jìn)骨和軟骨的形成，而且還可以控制間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞分化，對(duì)于骨的修復(fù)與保護(hù)發(fā)揮重要作用[10]。IGF是一種結(jié)構(gòu)類似胰島素的多肽，與糖代謝和骨代謝密切相關(guān)[11]。IGF-I不僅可以刺激骨細(xì)胞分化、增殖與代謝，而且也參與抑制膠原酶合成，減少膠原降解，促進(jìn)骨基質(zhì)合成與礦化[12]。

目前臨床對(duì)于防治DOP包括治療糖尿病原發(fā)病和改善骨質(zhì)疏松癥狀，針對(duì)糖尿病主要以控制血糖，減少及延緩并發(fā)癥為主；針對(duì)骨質(zhì)疏松主要以抑制骨吸收、降低骨轉(zhuǎn)換和促進(jìn)骨形成兩大類藥物干預(yù)[13]。本研究通過(guò)觀察雙膦酸鹽聯(lián)合降糖藥物對(duì)2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥大鼠BMP-2、TGF-β1、IGF-1表達(dá)的影響，結(jié)果表明雙膦酸鹽組、降糖藥組、聯(lián)合組糖代謝指標(biāo)較模型組均顯著改善(P<0.05)，雙膦酸鹽組、降糖藥組、聯(lián)合組骨組織骨密度和骨生物力學(xué)指標(biāo)較模型組均顯著升高(P<0.05)，雙膦酸鹽組、降糖藥組、聯(lián)合組骨組織BMP-2、TGF-β1和IGF-1 mRNA和蛋白表達(dá)較模型組均顯著升高(P<0.05)。分析其作用機(jī)制可能為阿侖膦酸鈉聯(lián)合二甲雙胍通過(guò)調(diào)控2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松大鼠相關(guān)細(xì)胞因子BMP-2、TGF-β1、IGF-1表達(dá)，以改善糖代謝，增加骨密度，提高骨生物力學(xué)性能。同樣，黃櫻等[14]研究表明二甲雙胍增加了阿侖膦酸鈉治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥合并2型糖尿病的臨床療效，提高骨密度、改善骨代謝指標(biāo)和降低VAS評(píng)分。孫國(guó)慶等[15]研究顯示DOP患者使用阿侖膦酸鈉聯(lián)合二甲雙胍治療，可有效改善其骨代謝及骨密度水平。黃錳等[16]研究表明二甲雙胍聯(lián)合阿侖膦酸鈉治療DOP患者，可降低患者糖代謝FPG、HbAlc水平，改善骨代謝指標(biāo)ALP、BGP、TRAP-5b、s-CTX水平，提高骨密度。阿侖膦酸鈉可有效抑制人機(jī)體內(nèi)破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的活性，抑制骨吸收和降低骨轉(zhuǎn)換，同時(shí)具有抑制糖吸收，促進(jìn)糖分解作用。二甲雙胍控制血糖的同時(shí)，提高成骨細(xì)胞活性，改善其骨密度及成骨過(guò)程，兩者聯(lián)合應(yīng)用于DOP，可同時(shí)改善其血糖及骨代謝水平，發(fā)揮有效防治DOP作用。

綜上所述，本研究初步認(rèn)為阿侖膦酸鈉聯(lián)合二甲雙胍可能通過(guò)調(diào)控激活2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松大鼠相關(guān)細(xì)胞因子BMP-2、TGF-β1和IGF-1的表達(dá)，改善糖代謝，增加骨密度，提高骨生物力學(xué)性能，從而發(fā)揮DOP的防治作用。本研究結(jié)果為我們后續(xù)研究留下了廣闊的研究空間，但具體詳細(xì)作用機(jī)制還有待我們進(jìn)一步深入研究，相信隨著對(duì)此展開(kāi)深入研究，將會(huì)為推動(dòng)防治DOP研究進(jìn)展提供新思路和新方法。