柯樂斌 錢小英 周垂楊 高仁賢

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是氣道阻塞的不完全可逆性，具有很高的死亡率和致殘率。COPD 發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，多種炎癥細(xì)胞的相互作用可以誘發(fā)氣道重塑和肺氣腫，進(jìn)而導(dǎo)致COPD 的形成[1]。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類RNA 轉(zhuǎn)錄物，參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生物學(xué)過程。研究指出，多種LncRNA 與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[2]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，LncRNA GM15621在炎性細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，表明LncRNA GM15621的表達(dá)與炎癥反應(yīng)相關(guān)[3-4]。本研究旨探討LncRNA GM15621 在COPD 病程的抗炎作用及其機(jī)制。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2014 年1 月—2019 年12 月在浙江省溫州市人民醫(yī)院呼吸科診治的COPD 患者198 例為COPD 組，選擇同期健康體檢者140 名為健康對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，并符合《赫爾辛基宣言》，納入本研究之前，所有患者均已簽署書面知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013 年修訂版）》中COPD 相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，并將COPD 患者分為Ⅰ期和Ⅱ期，其中COPD Ⅰ期患者97 例，COPD Ⅱ期患者101 例。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）COPD 病情嚴(yán)重為程度輕度～中度（對應(yīng)臨床分期Ⅰ期和Ⅱ期）；（2）年齡55～75 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并糖尿病、高血壓或高血脂患者；（2）患有惡性腫瘤的患者；（3）嚴(yán)重肺部疾病患者；（4）正在服用抗炎藥物的患者。

2 方 法

2.1 血清炎癥因子檢測 取健康志愿者或COPD 患者靜脈血3mL，添加入5μL 抗凝劑（擎科生物技術(shù)公司，中國）置于EP 管中，4℃下，1000r 離心5min，棄去沉淀，取上清，使用ELISA 試劑盒（百奧萊博，中國），采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗，并通過RT-6100 酶標(biāo)儀（CST，美國）檢測TNF-α（腫瘤壞死因子α，批號170219），IL-10（白介素-10，批號170928），IL-12（白介素-12，批號180326）以及IL-1β（白介素-1β，批號170518）水平。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 痰液炎癥細(xì)胞獲取：使用高滲鹽水通過超聲霧化滲入誘導(dǎo)患者和健康志愿者咳液，將痰液置入培養(yǎng)皿中，使用無菌的醫(yī)用鑷夾選取黏稠度較大的痰液，與0.1%二硫蘇糖醇（1：10，批號3483-12-3）搖勻，溫水浸泡后使用篩網(wǎng)過濾雜質(zhì)，用細(xì)胞沉渣涂片計數(shù)炎癥細(xì)胞后用添加10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（CST，美國，批號VS502T）進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期的炎癥細(xì)胞胰酶消化后，用DMEM 培養(yǎng)基（批號130071）調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個/mL，將細(xì)胞接種到96 孔板，室溫孵育24h，按照說明書分別使用Lipofectamine TM 2000 將miRNA-15621 mimics 或miRNA-NC（CST，美國）轉(zhuǎn)染COPD患者來源的炎癥細(xì)胞，分為miRNA-15621 mimics組和miR-NC 組，檢測轉(zhuǎn)染效率。

2.3 蛋白免疫印跡 將COPD 患者來源細(xì)胞分為對照組細(xì)胞、miR-NC 組、miRNA-15621 mimics 組以及PI3K 抑制劑組（PI3KI）。對照組細(xì)胞添加DMSO 進(jìn)行處理，miR-NC 組細(xì)胞添加轉(zhuǎn)染對照物miR-NC，PI3KI 組細(xì)胞添加不同濃度的PI3K 抑制劑BEZ-235（碧云天試劑公司，中國，批號915019-65-7）進(jìn)行處理，miRNA-15621 mimics 組添加不同濃度的miRNA-15621 mimics 進(jìn)行處理，處理24h 后，胰酶消化收集細(xì)胞；使用雙辛可寧酸（BCA）蛋白質(zhì)檢測試劑盒（Applygen Technologies，中國，批號at-47247）確定對照組，miR-NC 組細(xì)胞，miRNA-15621 mimics組，PIKI 組以及健康對照組來源細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離等量的蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜與p-Akt 一抗（1：1000；Cell Signaling Technology，美國，cst-4007） 和甘油醛-3 脫氫酶（GAPDH，1：500；Santa CruzBiotechnology，美國，批號sc-20177）4°C 孵育過夜，TBST 洗滌三次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠二抗（1：500；Cell Signaling Technology，美國，批號sct-20977）室溫孵育1h，TBST 洗滌三次后添加CEL顯影蛋白（擎科生物技術(shù)公司，中國），并使用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientifc，美國）檢測免疫反應(yīng)蛋白。

2.4 RNA 分離和qRT-PCR 分析 根據(jù)制造商的說明，使用Trizol 試劑（百奧萊博，中國，批號28870）從COPD 患者來源細(xì)胞和健康志愿者來源的炎癥細(xì)胞中分離總RNA。通過紫外分光光度法檢測RNA 濃度和純度，使用PrimeScript RT Master Mix Kit 將2μg總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（Takara，日本），隨后依據(jù)qPCR 說明書，使用Mx3000P 實時PCR 系統(tǒng)（安捷倫，美國）執(zhí)行實時PCR。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性45s；90℃15s；60℃30s；70℃45s，共60 個循環(huán)，miR-15621 正向引物：5′-CCGTAAGTGGCGCACGGAAT-3′，反向引物：5′-GGCATTCACCGCGTGCCTTA-3′；U6 正向引物：5′-GATTTCTCCCTCATCGCTTACAG-3′，反向引物：5′-CTGCTTCATGATCGTTGTTGCTTG-3′，以U6 為內(nèi)參，所用PCR 引物均由浙江格魯斯特生物技術(shù)公司（中國）合成。

2.5 隨 訪 采用門診及電話對COPD 患者進(jìn)行肺康復(fù)治療后隨訪，隨訪時間截至2019 年12 月?？偵嫫冢∣S）為患者接受肺康復(fù)治療時間至患者死亡時間或末次隨訪時間，同時記錄患者術(shù)后生存情況。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，兩組間比較采用獨立t 檢驗，多組間比較先進(jìn)行單因素方差分析后進(jìn)行LSD-t 檢驗，計數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較實施χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 COPD 患者與健康對照者一般資料比較 COPD組198 例中男122 例，女76 例，年齡58～75 歲，年齡＞65 歲者72 例，有吸煙史患者84 例；健康對照組140 名中男78 名，女62 名，年齡57～73 歲，年齡＞65歲者56 名，有吸煙史者50 名，兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 COPD 患者與健康對照組LncRNA GM15621定量比較 與健康對照組比較，COPD 組患者血清炎癥細(xì)胞LncRNA GM15621 含量明顯減少（0.73±0.06比1.27±0.10，P＜0.05）。

3.3 COPD 患者影響因素預(yù)后分析 多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，COPD 患者臨床分期以及LncRNA GM15621 與COPD 患者的總體生存期顯著相關(guān)，表明LncRNA GM15621 表達(dá)可作為COPD 患者生存的獨立預(yù)測因子，見表1。

表1 單變量回歸分析模型中不同因素對COPD 患者總生存期的影響

3.4 COPD 患者血清LncRNA GM15621 表達(dá)量與總生存期相關(guān)性分析 以檢測的198 例COPD 患者血清LncRNA GM15621 表達(dá)量中位數(shù)2.023 為界線，將198 例COPD 患者分為低表達(dá)組（n=57）和高表達(dá)組（n=141），統(tǒng)計分析LncRNA GM15621 表達(dá)量與COPD 患者總體生存期和無病生存期的關(guān)系，評價LncRNA GM15621 對COPD 患者預(yù)后的判斷價值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與LncRNA GM15621 低表達(dá)組比較，LncRNA GM15621 高表達(dá)組總體生存期和無病生存期（DFS）顯著延長（P 均＜0.05），見表2-3。

表2 COPD 患者血清LncRNA GM15621 表達(dá)量與總生存期相關(guān)分析

表3 COPD 患者血清LncRNA GM15621 表達(dá)量與無病生存期相關(guān)分析

3.5 COPD 患者與健康對照組患者血清炎癥因子定量比較 與健康對照組比較，COPD 患者血清炎癥因子TNF-α，IL-1β 和IL-12 含量明顯升高，抗炎因子IL-10 水平明顯降低（P＜0.05）。見表4。

3.6 LncRNA GM15621 通過PI3K/Akt 發(fā)揮抗炎作用 與健康對照組比較，患者來源的對照組細(xì)胞中p-Akt 磷酸化明顯增加，而添加miR-NC 對其表達(dá)無影響（見圖1）；與miR-NC 對照組比較，添加miRNA 15621-mimics 處理后，p-Akt 表達(dá)明顯減少，炎癥因子的表達(dá)明顯減少，抗炎因子IL-10 表達(dá)明顯增加（見表5），使用PI3K 抑制劑BEZ-235 處理后，細(xì)胞p-Akt 表達(dá)顯著降低（見圖2）。表明LncRNA GM15621 部分通過PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其抗炎作用。

表4 健康對照組和COPD 組患者血清炎癥相關(guān)因子水平比較（pg/mL，）

表4 健康對照組和COPD 組患者血清炎癥相關(guān)因子水平比較（pg/mL，）

注：IL-1β 為白介素-1β；IL-12 為白介素-12；TNF-α 為腫瘤壞死因子α；IL-10 為白介素-10；COPD 為慢性阻塞性肺病；與健康對照組比較，aP＜0.05

表5 不同濃度miRNA 15621-mimics 處理后細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)因子表達(dá)水平（pg/mL，）

表5 不同濃度miRNA 15621-mimics 處理后細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)因子表達(dá)水平（pg/mL，）

注：IL-1β 為白介素-1β；IL-12 為白介素-12；TNF-α 為腫瘤壞死因子α；IL-10 為白介素-10；與miR-NC 組比較，aP＜0.05

圖1 不同濃度miRNA15621 mimics 處理后p-Akt 表達(dá)

圖2 不同濃度PIK3 抑制劑或LNCRNA GM15621 模擬物處理后p-Akt 表達(dá)

4 討論

近年研究表明，包括LncRNA GM15621 在內(nèi)的多種LncRNA 參與包括COPD 在內(nèi)的多種人類炎癥性疾病的發(fā)生。LncRNA GM15621 又被稱為為primiR-15621，在哺乳動物組織或器官（如肝、肺和腎）中廣泛表達(dá)[6]。MiR-15621 是特征最明確的miRNA之一，在活化的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)，在多種生理和病理過程中起著關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)報道，糖皮質(zhì)激素可以通過miR-15621 對LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗炎作用[7-8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COPD 患者炎癥細(xì)胞LncRNA GM15621 表達(dá)低于健康對照組，且與不良預(yù)后密切相關(guān)，表明LncRNA GM15621 參與COPD 的發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，COPD 患者血清炎癥因子TNF-α，IL-1β 和IL-12 含量明顯升高，而LncRNA GM15621 上調(diào)可以抑制炎癥因子表達(dá)，提高抗炎因子IL-10 水平。

PI3K/Akt 廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞內(nèi)的主要信號通路之一，廣泛參與包括多種生物學(xué)過程，通過激活PI3K/Akt 通路可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放，參與COPD 的發(fā)病[9]。研究指出，脂多糖（LPS）誘導(dǎo)PI3Kp110/p85 異二聚體的核易位，從而調(diào)節(jié)LncRNA GM15621 的表達(dá)，表明LncRNA GM15621 可能是PI3K 的靶基因[10-11]。本研究結(jié)果顯示，相對于健康對照組，COPD 患者來源的細(xì)胞磷酸化Akt 表達(dá)顯著增高，炎癥因子的表達(dá)明顯增加，使用PI3K 抑制劑處理或使用LncRNA GM15621 誘導(dǎo)細(xì)胞過表達(dá)后，磷酸化Akt 表達(dá)明顯減少，炎癥因子表達(dá)顯著降低，抗炎因子表達(dá)明顯增加，提示LncRNA GM15621 可能通過PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其抗炎作用。

總之，本研究表明，COPD 患者炎癥細(xì)胞LncRNA GM15621 表達(dá)顯著降低，炎癥因子含量明顯升高，抗炎因子水平顯著降低，此外，LncRNA 低表達(dá)與COPD 不良預(yù)后密切相關(guān)，過表達(dá)的LncRNA GM15621 可能通過PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制炎癥因子表達(dá)，提高抗炎因子水平，從而抑制炎癥反應(yīng)，延長患者無病生存期和總生存期。