李俏俏 鄭 靜 徐婷婷

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）被定義為可預(yù)防和治療的疾病，伴有嚴(yán)重的肺外作用，增加患者的嚴(yán)重程度風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。白細(xì)胞介素-6 受體（interleukin-6 receptor，IL-6R）是一種模式識(shí)別受體，可與微生物表面的抗原特異性結(jié)合，從而激活補(bǔ)體系統(tǒng)。IL-6R 與COPD 急性加重相關(guān)。研究表明，IL-6R 基因編碼和啟動(dòng)子區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性對(duì)血清IL-6R 水平有功能影響，IL-6R 基因突變型AA 與兒童呼吸道感染頻率、早期感染發(fā)作及成人系統(tǒng)性紅斑狼瘡、高侵襲性肺炎球菌感染密切相關(guān)[3-4]，而攜帶IL-6R 變異等位基因型GG的兒童在化療期間出現(xiàn)發(fā)熱性中性粒細(xì)胞減少癥[5]。目前關(guān)于IL-6R 及其基因突變與COPD 相關(guān)性研究較少。本研究擬探討IL-6R 基因突變型與COPD 的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院呼吸內(nèi)科2018 年3 月—2019 年10 月確診COPD 患者78 例為COPD 組，肺功能分級(jí)[6]：Ⅱ級(jí)42 例，Ⅲ級(jí)19 例，Ⅳ級(jí)11 例，Ⅴ級(jí)6 例。另取浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院門(mén)診健康體檢者134 名作為對(duì)照組，對(duì)照組受試者肺活量測(cè)定正常。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)（審批號(hào)：倫審字2018-0029），所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均符合COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，無(wú)支氣管擴(kuò)張、支氣管哮喘、肺癌、肺結(jié)核等其他呼吸系統(tǒng)疾??；（2）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕婦，近3 個(gè)月有手術(shù)、創(chuàng)傷史；（2）嚴(yán)重心血管疾?。唬?）糖尿病、自身免疫性疾病、消化道和泌尿系統(tǒng)等其他感染。

1.3 主要試劑及儀器 TRIzol 試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司，批號(hào)15596026）；PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄（RT） 試劑盒（寶生物工程大連有限公司，批號(hào)RRO37A）；EPS-100 型電泳儀（上海天能科技有限公司）；7500 型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（美國(guó)ABI 公司）；BTL-08 SPIRO 型肺功能測(cè)量?jī)x（英國(guó)比特勒公司）。

1.4 IL-6R 基因rs4845617 單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)根據(jù)說(shuō)明使用TRIzol 試劑盒分離血液總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確定RNA 的完整性。使用PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并將產(chǎn)物保存在冰箱中以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀擴(kuò)增靶基因。IL-6R 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。IL-6R 上游引物：5'-TGTGAGTCGGAGAGGCTGTGACTG-3'；下游引物：5'-CGTAACTGATTCCTCGTGACTACC-3'。探針（C）：5'-VIC-TGTGTGCGTAACTGGCGGTGC-MGB-3'；探針（T）5'-FAM-CTGGACTGACCGT-MGB-3'；所有反應(yīng)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)部參考，通過(guò)相對(duì)定量（2-ΔΔCT 方法）計(jì)算倍數(shù)變化。PCR 條件是在94℃初始變性3min；在55℃退火，在72℃延伸35 個(gè)循環(huán)，最后在72℃延長(zhǎng)7min，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)，61℃時(shí)采集熒光。連接酶檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)SNP。目的基因及內(nèi)參基因的2%瓊脂糖凝膠電泳（見(jiàn)圖1）。變性梯度凝膠電泳檢測(cè)IL-6R 基因的rs4845617 單核苷酸多態(tài)性（見(jiàn)圖2）。IL-6R 基因第6 外顯子-32G/A 正向位點(diǎn)測(cè)序圖，見(jiàn)圖3。

1.5 COPD 患者肺功能指標(biāo)測(cè)定 肺功能測(cè)量?jī)x測(cè)定患者靜息狀態(tài)下用力肺活量（FVC）、一秒鐘用力呼氣容積（FEV1）、最大呼氣中段流量（MMEF）。

圖1 目的基因及內(nèi)參基因2%瓊脂糖凝膠電泳

圖2 IL-6R 基因變性梯度凝膠電泳

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 描述，采用t 檢驗(yàn)和單因素方差分析比較，多重比較采用SNK-q 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）描述，采用χ2檢驗(yàn)比較；多態(tài)性位點(diǎn)的基因型與易療效的風(fēng)險(xiǎn)分析采用二元Logistic 回歸分析，以O(shè)R 及95%CI表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與COPD 組一般資料比較 兩組受試者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)照組與COPD 組IL-6R rs4845617 各基因型突變型比較 與對(duì)照組比較，COPD 組IL-6R rs4845617 AA 基因型比例升高，GG 基因型比例降低（P＜0.05）；與IL-6R rs4845617 AG、GG 基因型比較，IL-6R rs4845617 AA 基因型COPD 易感性明顯增加（OR=2.418、95% CI=1.748～3.345，P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表1 對(duì)照組與COPD 組一般資料比較

表2 對(duì)照組與COPD 組IL-6R rs4845617 各基因型突變型比較[例（%）]

2.3 對(duì)照組與COPD 組IL-6R rs4845617 各等位基因突變頻率比較 與對(duì)照組比較，COPD 組IL-6R rs4845617 A 等位基因頻率比例升高，IL-6R rs4845617 G 等位基因頻率比例降低（P＜0.05）；IL-6R rs4845617 G 等位基因頻率比較，IL -6R rs4845617 A 等位基因頻率COPD 易感性增加（OR=2.911、95% CI=2.220～3.818，P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 對(duì)照組與COPD 組IL-6R rs4845617 各等位基因突變頻率比較[例（%）]

2.4 COPD 患者各基因組肺功能指標(biāo)比較 COPD組AG、GG 型FEV1、FEV1/FVC、MMEF 水平高于AA型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；GG 型FEV1、FEV1/FVC、MMEF 水平高于AG 型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

圖3 IL-6R 基因第6 外顯子-32G/A 正向位點(diǎn)測(cè)序圖

表4 COPD 患者各基因組肺功能指標(biāo)比較（）

表4 COPD 患者各基因組肺功能指標(biāo)比較（）

注：COPD 為慢性阻塞性肺疾?。籉EV1 為一秒鐘用力呼氣容積；FEV1/FVC 為一秒鐘用力呼氣容積/靜息狀態(tài)下用力肺活量；MMEF為最大呼氣中段流量；與AA 型比較，aP＜0.05；與AG 型比較，bP＜0.05

2.5 COPD 患者AA 基因型與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)分析 隨著COPD 病情嚴(yán)重程度逐漸增加，AA 基因型比例逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 COPD 患者AA 基因型與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)分析[例（%）]

3 討論

IL-6R 的突變基因型與成人和兒童呼吸道感染風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[8]。IL-6R 的外顯子中的三個(gè)多態(tài)型由230AA（密碼子54B 等位基因），239AG（密碼子57C等位基因）和223GG（密碼子52D 等位基因）組成，這些等位基因的單倍型在IL-6R 的啟動(dòng)子區(qū)域具有變異，特別是在位置≥32（A/G 等位基因）[9-11]。IL-6R 在結(jié)構(gòu)多態(tài)性和某些啟動(dòng)子單倍型之間觀察到連鎖不平衡，并且外顯子多態(tài)性可能對(duì)血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平具有更大的影響。臨床研究證實(shí)，“高生產(chǎn)者等位基因”IL-6R rs4845617 AA 患者會(huì)發(fā)生免疫學(xué)炎癥性疾病，例如炎癥性腸病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[12]。IL-6R 啟動(dòng)子區(qū)域AA 等位基因傾向與脂多糖刺激的IL-6 產(chǎn)生增加有關(guān)。攜帶AA等位基因的兒童在感染呼吸道合胞病毒后細(xì)支氣管炎的發(fā)生率明顯高于其他基因型兒童，而嚴(yán)重呼吸道合胞病毒（RSV）感染是COPD 發(fā)生的危險(xiǎn)因素[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，COPD 組IL-6R rs4845617 AA 基因型比例升高，IL-6R rs4845617 AA 基因型COPD 易感性增加（OR=2.418、95%CI=1.748～3.345，P＜0.05）。表明，IL-6R rs4845617 AA 基因型與COPD 易感性相關(guān)。

研究觀察到，脂多糖刺激后IL-6R rs4845617 A表達(dá)增加[14]。在本研究中，與對(duì)照組比較，COPD 組IL-6R rs4845617 A 等位基因頻率比例升高，IL-6R rs4845617 A 等位基因頻率COPD 易感性增加（OR=2.911、95%CI=2.220～3.818，P＜0.05），也說(shuō)明IL-6R rs4845617 A 等位基因在COPD 患者中更為常見(jiàn)。

研究發(fā)現(xiàn)，IL-6R 等位基因與COPD 和哮喘相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)支持這樣的觀點(diǎn)，即雖然哮喘和COPD是不同的疾病，但至少部分遺傳易感性可能是相同的[15]。通過(guò)對(duì)染色體2q 上的IL-6R 區(qū)域在全基因組進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，AA 型基因能降低FEV1、FEV1/FVC、MMEF 水平，GG 型基因能升高FEV1、FEV1/FVC、MMEF 水平。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，隨著慢性阻塞性肺疾病嚴(yán)重程度逐漸增加，AA 基因型比例逐漸升高，這提示AA 基因型可能加重COPD 嚴(yán)重程度。研究表明，同一地區(qū)哮喘患者IL-6R rs4845617 AA 型患者具有較高水平的血清總免疫球蛋白E（IgE）水平，而血清總IgE 水平已被證實(shí)與哮喘和支氣管高反應(yīng)性有關(guān)[14]。結(jié)合本次研究結(jié)果，推測(cè)COPD 嚴(yán)重程度增加可能與IL-6R 基因突變型AA 導(dǎo)致的高水平IgE 有關(guān)。然而，這種推測(cè)不能排除其他候選基因位點(diǎn)，并且這種關(guān)聯(lián)可能是由于存在連鎖不平衡的不同易感基因?qū)е?。為排除這種偏倚，需要更多的樣本量，這將在后續(xù)研究進(jìn)行。

綜上所述，IL-6R rs4845617 基因突變型AA 能增加慢性阻塞性肺疾病的易感性。