陳一洲 葉勇健 李之斌 陳丹琦

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一類(lèi)以骨量流失，骨微結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致骨骼脆性增加的代謝性疾病。中醫(yī)認(rèn)為，PMOP 屬于“骨萎”范疇，其根本病機(jī)為“腎虛”。金匱腎氣丸作為溫補(bǔ)腎陽(yáng)的經(jīng)典代表方[1]，廣泛應(yīng)用于PMOP 患者的治療，取得一定的臨床療效。經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在骨穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用，其缺失或過(guò)度活化會(huì)導(dǎo)致骨量的驟降或激增[2-3]，是治療PMOP 重要的分子靶點(diǎn)[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)金匱腎氣丸干預(yù)去勢(shì)骨質(zhì)疏松小鼠模型，驗(yàn)證金匱腎氣丸防治PMOP 的療效，進(jìn)一步探討其對(duì)β-catenin 信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物 雌性10 周齡C57BL/6 小鼠24 只，體質(zhì)量（20±2）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0008；使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2019-0015]。小鼠飼養(yǎng)在濕度（40±5）%、溫度（23±2）℃，晝夜12h 更替的環(huán)境下，可自由飲水和進(jìn)食。本研究經(jīng)浙江省寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審核[審批號(hào)：（2019）倫審（31）號(hào)]。

1.2 藥物及試劑 戊巴比妥粉（中生瑞泰科技有限公司，批號(hào)921019），青霉素（規(guī)格：80 萬(wàn)單位，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)10121909073），4%多聚甲醛（Solarbio 公司，批號(hào)P1110），Alcian blue/hematoxylon（ABH）染液（Sigma 公司，美國(guó)，批號(hào)17372-87-1），Orange G 染液（Sigma 公司，美國(guó)，批號(hào)1936-15-8），核酸檢測(cè)試劑盒（Takara 公司，日本，批號(hào)9534），金匱腎氣丸（規(guī)格：72g/瓶，北京同仁堂，批號(hào)Z11020147）。

1.3 主要儀器 蔡司顯微鏡（Zeiss 公司，德國(guó)），Micro-CT（Skyscan 1170，Bruker 公司，比利時(shí)），骨形態(tài)計(jì)量?jī)x（Osteometrics 公司，美國(guó)），熒光定量PCR儀（Termor 公司，美國(guó)）。

1.4 小鼠造模及分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法，將小鼠分成假手術(shù)組、模型組和金匱腎氣丸組，每組8 只。造模方法：腹腔注射0.3%戊巴比妥（0.1mL/10g）麻醉后，常規(guī)皮膚剃毛消毒，于背部正中線(xiàn)作長(zhǎng)約1.5cm的切口，沿背部肋弓緣、腰椎旁逐層進(jìn)入腹腔，暴露兩側(cè)卵巢及輸卵管。其中模型組和金匱腎氣丸組摘除雙側(cè)卵巢及結(jié)扎輸卵管；假手術(shù)組8 只，摘除雙側(cè)卵巢周?chē)攘恐窘M織。檢查無(wú)活動(dòng)性出血，逐層縫合傷口。術(shù)后連續(xù)3 天腹腔注射青霉素（每次6 萬(wàn)，每天1 次）預(yù)防感染。

1.5 藥物干預(yù) 術(shù)后觀察3 天，所有小鼠均未出現(xiàn)切口感染或死亡，第4 天起開(kāi)始藥物干預(yù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)小鼠與成人的體表面積比例進(jìn)行劑量換算[5]，每只小鼠（體質(zhì)量按20g 計(jì)算）灌胃劑量為0.2mL/天。金匱腎氣丸組小鼠予金匱腎氣丸溶液（72g 腎氣丸加熱溶于100mL 蒸餾水中，繼續(xù)加熱濃縮至含生藥1g/mL）0.2mL/天連續(xù)灌胃8 周。模型組小鼠給予等體積0.9%生理鹽水灌胃，假手術(shù)組小鼠不作處理。

表1 小鼠Micro-CT 骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較（）

表1 小鼠Micro-CT 骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較（）

注：假手術(shù)組予切除等量脂肪組織；模型組予切除雙側(cè)卵巢；金匱腎氣丸組予切除雙側(cè)卵巢+金匱腎氣丸灌胃；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

1.6 Micro-CT 掃描分析 造模8 周后，摘取小鼠左側(cè)股骨，剔除周?chē)浗M織，置于Micro-CT 進(jìn)行掃描檢測(cè)。掃描參數(shù)為：分辨率4000×2672，鋁板0.2μm，掃描層厚為10μm。骨微結(jié)構(gòu)重點(diǎn)分析股骨干骺端松質(zhì)骨的區(qū)域，具體檢測(cè)參數(shù)為：骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目、骨小梁間距和骨小梁厚度。

1.7 樣本制作 Micro-CT 掃描完成后，將股骨組織置于4%多聚甲醛中固定48h，隨后進(jìn)行脫鈣、脫水及石蠟包埋處理，制作成3μm 厚度的石蠟切片。

1.8 特殊染色及定量分析 完成脫蠟復(fù)水后，將切片置于ABH 染液染色1h。0.3%鹽酸酒精分化、1%氨水返藍(lán)后，置于Orange G 染液浸洗1min。純水清洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，透明樹(shù)脂封片。使用骨形態(tài)計(jì)量?jī)x對(duì)染色后的切片進(jìn)行組織形態(tài)定量分析，包括骨小梁面積分?jǐn)?shù)（%）、脂肪空泡面積比（%）和脂肪空泡直徑（μm）。

1.9 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR） 摘取小鼠右側(cè)股骨，剔除周?chē)浗M織，PBS 清洗3 遍后，按照核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)β-catenin、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（Osterix），堿性磷酸酶（ALP）mRNA 表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 金匱腎氣丸延緩PMOP 小鼠骨量流失 Micro-CT 檢測(cè)分析顯示，與假手術(shù)組比較，去卵巢后模型組小鼠股骨骨密度下降，骨結(jié)構(gòu)破壞，骨小梁數(shù)量減少，間距增大（P 均＜0.05），提示去卵巢PMOP 小鼠模型建立成功；與模型組比較，金匱腎氣丸組小鼠骨密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目和骨小梁間距均顯著改善（P 均＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 金匱腎氣丸改善PMOP 小鼠股骨遠(yuǎn)端骨髓腔結(jié)構(gòu) 小鼠骨組織經(jīng)ABH 染色后，骨小梁呈橘色，骨髓細(xì)胞呈紫色和脂肪空泡呈白色圓形。ABH 染色及骨組織形態(tài)計(jì)量分析結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏，髓腔內(nèi)骨髓細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)大量脂肪空泡。骨面積分?jǐn)?shù)減少，脂肪空泡面積比和直徑變大（P 均＜0.05）；金匱腎氣丸治療后，小鼠股骨骨小梁明顯增粗，髓腔內(nèi)骨髓細(xì)胞數(shù)量增多且排列有序。骨面積分?jǐn)?shù)增加，脂肪空泡面積及直徑顯著減小（P 均＜0.05）。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 小鼠股骨病理（ABH 染色×100 倍）

表2 小鼠骨組織形態(tài)定量分析（）

表2 小鼠骨組織形態(tài)定量分析（）

注：假手術(shù)組予切除等量脂肪組織；模型組予切除雙側(cè)卵巢；金匱腎氣丸組予切除雙側(cè)卵巢+金匱腎氣丸灌胃；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

2.3 金匱腎氣丸促進(jìn)β-catenin 及其下游成骨基因表達(dá) mRNA 定量檢測(cè)分析結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組β-catenin 及下游的成骨基因Osterix和ALP 表達(dá)顯著下降（P 均＜0.05）；與模型組比較，金匱腎氣丸干預(yù)8 周后，β-catenin、Osterix 和ALP的mRNA 表達(dá)明顯改善（P 均＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 β-catenin、Osterix 及ALP mRNA 定量分析（IOD/Area，）

表3 β-catenin、Osterix 及ALP mRNA 定量分析（IOD/Area，）

注：假手術(shù)組予切除等量脂肪組織；模型組予切除雙側(cè)卵巢；金匱腎氣丸組予切除雙側(cè)卵巢+金匱腎氣丸灌胃；β-catenin 為β 連環(huán)蛋白；Osterix 為結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子；ALP 為堿性磷酸酶；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

3 討論

PMOP 是一類(lèi)與干細(xì)胞分化異常相關(guān)的骨代謝性疾病[6-7]。干細(xì)胞具有自我更新及持續(xù)成骨分化的能力，在機(jī)體骨穩(wěn)態(tài)維持中起關(guān)鍵作用。干細(xì)胞表面表達(dá)有雌激素受體，與雌激素特異性結(jié)合后，能促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，抑制其成脂肪分化[8]。女性絕經(jīng)后，雌激素水平下降，導(dǎo)致干細(xì)胞成骨-成脂分化異常，是PMOP 重要的細(xì)胞學(xué)發(fā)病機(jī)制。

根據(jù)中醫(yī)“腎藏精主骨”理論，中醫(yī)治療PMOP重在“補(bǔ)腎”。《醫(yī)經(jīng)精義》指出，“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，故骨者，腎之合也”。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，“腎藏精主骨”的科學(xué)內(nèi)涵主要體現(xiàn)在通過(guò)補(bǔ)腎來(lái)調(diào)控干細(xì)胞的增殖分化狀態(tài)，進(jìn)而影響骨量和骨微結(jié)構(gòu)[9-10]。金匱腎氣丸是“補(bǔ)腎”的經(jīng)典方劑，其干預(yù)PMOP 可能是通過(guò)調(diào)控干細(xì)胞的分化實(shí)現(xiàn)的。

β-catenin 作為一個(gè)肌肉骨骼分子調(diào)控開(kāi)關(guān)，能夠決定干細(xì)胞分化方向。經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路中，Wnt配體與細(xì)胞膜表面受體Frizzled 和LRP5/6 相結(jié)合，募集Disheveled 和Axin，破壞了穩(wěn)定的四聚體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致胞漿內(nèi)β-catenin 堆積，經(jīng)跨核膜轉(zhuǎn)激活下游成骨靶基因表達(dá)[11]。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究表明，β-catenin基因缺失會(huì)導(dǎo)致骨形成及骨礦化能力下降，出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松表型[12]。由此提示，β-catenin 是治療骨質(zhì)疏松癥潛在的分子靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠骨量較假手術(shù)組顯著下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞明顯，提示PMOP 小鼠模型成功建立。金匱腎氣丸干預(yù)8 周后，PMOP 小鼠骨量丟失減少，證明金匱腎氣丸能夠有效防治去勢(shì)小鼠PMOP 的發(fā)生。病理上，造模組小鼠骨小梁稀疏，髓腔內(nèi)脂肪空泡堆積；金匱腎氣丸治療后，脂肪空泡數(shù)量顯著減少，并且代替以正常的骨髓細(xì)胞及骨小梁，提示去勢(shì)造模后，小鼠骨內(nèi)存在干細(xì)胞成骨-成脂分化異常，而金匱腎氣丸能夠調(diào)控干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，從而改善小鼠骨量丟失。Osterix 和ALP 是經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號(hào)通路下游的成骨靶基因。Osterix是MSCs 成骨分化的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，ALP 具有促進(jìn)羥磷灰石沉積，能夠反映成骨形成能力。qRTPCR 結(jié)果顯示，去勢(shì)造模后，小鼠股骨β-catenin 及下游Osterix 和ALP 的mRNA 表達(dá)明顯減少，可能導(dǎo)致干細(xì)胞成骨分化減弱。金匱腎氣丸能夠激活βcatenin 信號(hào)通路，促進(jìn)下游的Osterix 和ALP 靶基因的表達(dá)，影響MSCs 成骨-成脂分化，延緩去勢(shì)小鼠骨量流失和骨微結(jié)構(gòu)破壞。

綜上所述，金匱腎氣丸可能通過(guò)激活β-catenin信號(hào)通路及下游Osterix、ALP 成骨基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控干細(xì)胞成骨分化，防治去勢(shì)小鼠骨質(zhì)疏松。