陳彩萍 徐 琦 趙海菲

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌，肝癌早期診斷率極低，浸潤轉(zhuǎn)移是HCC 術(shù)后高復(fù)發(fā)率的主要原因。浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究對(duì)于提高肝癌早期診斷及其生存率具有重要意義[1-3]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是腫瘤新生血管生長重要調(diào)控因素，文獻(xiàn)報(bào)道，VEGF 在肝癌組織和細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)異常高表達(dá)[4-6]。本研究觀察姜黃素對(duì)肝癌細(xì)胞miR-29 及VEGF 表達(dá)的干預(yù)作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2008 年12 月1 日—2018 年12 月1 日期間就診于杭州市腫瘤醫(yī)院臨床資料較完整的手術(shù)切除肝癌標(biāo)本41 份，含癌組織和癌旁非癌組織，其中病理組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)5 例，Ⅱ級(jí)14 例，Ⅲ級(jí)17 例，Ⅳ級(jí)5 例（由病理科醫(yī)師根據(jù)Edmondson標(biāo)準(zhǔn)[7]分級(jí)，Ⅰ～Ⅱ級(jí)為高分化，Ⅲ～Ⅳ級(jí)為低分化）。同時(shí)取10 份患者正常肝組織活檢作為對(duì)照。41 例肝癌患者中男34 例，女7 例，中位年齡50.1（23～71）歲，所有患者術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。所有參與本研究者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過（倫理批號(hào)：20170122）。

1.2 細(xì)胞株 LO2 人正常肝細(xì)胞（ZQ0031）、HepG2人肝癌細(xì)胞株購自于上海生化細(xì)胞所（H019）。

1.3 藥 品 姜黃素購自上海試劑二廠重慶站（分析純，批號(hào)71012660）。姜黃素溶液配制：姜黃素溶液以少量二甲亞砜（DMSO）溶解姜黃素粉劑，配成1mmol/L 溶液（儲(chǔ)蓄液），置于-20℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用倍比稀釋配成最終濃度為7.46、14.92、29.84、59.68、119.36μmol/L 五種濃度，將肝癌HepG2 細(xì)胞制成5×104/mL 懸液，種植于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200μL。實(shí)驗(yàn)設(shè)試劑對(duì)照組（每孔加DMSO 20μL）、腫瘤細(xì)胞陰性對(duì)照組及五種不同濃度的實(shí)驗(yàn)組（每孔加姜黃素20μL），每組平行孔位8 孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72h 后吸取上清液，加入無血清培養(yǎng)液200μL，MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.4 試劑及儀器 胎牛血清（美國Gibco 公司，批號(hào)16000-044），轉(zhuǎn)錄試劑盒（MBI Fermantas 公司，批號(hào)DP441），RMPI1640（美國HyClone 公司，批號(hào)AH 30809.01），TRLzolRNA 抽提試劑盒（TOYOBO 公司，批號(hào)410800），實(shí)時(shí)定量SYBR Green PCR Master Mixture 試劑盒（TianGen 公司，批號(hào)FP202-01），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（QIANGEN 公司，批號(hào)34-405）、鼠抗人單克隆VEGF 一抗（福州邁新公司），生物素標(biāo)記的第二抗體、SP 試劑盒、DAB 顯色劑均購自福州邁新公司；PCR 引物序列（上海吉瑪基因）：Has-miR-29上游引物：5'-UAGCACCAGCUGUGAAAUCGGUUA-3'，下游引物為：5'-CTCAACTGGTCGTGGA-3'；U6 上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；U6 下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；PCR 儀（美國Agilent 公司，型號(hào)：ProFlex），高速離心機(jī)（美國Thermo Scientific，型號(hào)：CL10），核酸定量檢測(cè)儀（美國Eppendorf 公司，型號(hào)：BioPhotometer D30）。

1.5 免疫組化檢查 將上述組織標(biāo)本切片脫蠟脫水后，加入3%雙氧水中滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加0.01M（pH=6.0）檸檬酸鹽緩沖液于微波盒中，微波加熱至100℃進(jìn)行抗原修復(fù)，分別滴加一抗（1:50）后以PBS 作為一抗陰性對(duì)照，室溫孵育60min，然后0.01M PBS 液沖洗5min，重復(fù)3 次。滴加生物素標(biāo)記的二抗后蘇木素復(fù)染1min，蒸餾水沖洗3min，重復(fù)2次，切片經(jīng)梯度酒精水干燥，純二甲苯透明，中性樹膠封固觀測(cè)結(jié)果。結(jié)果判定：VEGF 蛋白陽性信號(hào)呈細(xì)胞漿或胞膜棕黃色著色，觀察5 個(gè)具有代表性的高倍視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)比值，其中，+為10%～25%陽性細(xì)胞；++為陽性細(xì)胞在26%～50%；+++為陽性細(xì)胞＞50%，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性[8]。原發(fā)性肝癌的分期按國際惡性腫瘤聯(lián)盟（UICG）TNM 分類標(biāo)準(zhǔn)[7]，腫瘤直徑≤3cm 為小肝癌，＞3cm 者為大肝癌。將有癌栓和/或肝內(nèi)播散和/或0.5a 內(nèi)復(fù)發(fā)的HCC 患者定為低轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng) LO2 人正常肝細(xì)胞、HepG2 人肝癌細(xì)胞株均使用含20%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，鏡下觀察，細(xì)胞生長匯合度接近80%～90%時(shí)，使用0.25%的胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代。

1.7 組織標(biāo)本和細(xì)胞總RNA 抽提及RT-PCR 檢測(cè)在組織或細(xì)胞內(nèi)加入適量TrizoL 后，高速研磨，4℃離心，加入異丙醇后棄上清，加入1mL 75%乙醇渦旋混勻，室溫干燥5～10min 后，加入10μL DEPC水溶解，分光光度儀測(cè)定RNA 濃度及OD 值，后續(xù)參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以U6 作內(nèi)參基因/核基因，將DNA 樣品用DEPC 水稀釋至50ng/μL，建立25μL 反應(yīng)體系見表1。

表1 25 μL 反應(yīng)體系成分及體積

RT-PCR 循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95℃10min；變性95℃15s，復(fù)性60℃1min，延伸72℃1min，共40 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。每組設(shè)定6 個(gè)復(fù)孔。擴(kuò)增結(jié)束后軟件分析計(jì)算DNA 相對(duì)表達(dá)量，使用7500 RT-PCR System 的分析軟件，將對(duì)照組細(xì)胞ND1/U6的比值設(shè)定為1，利用Comparative CT 方法計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)拷貝數(shù)。

1.8 蛋白免疫印跡 細(xì)胞經(jīng)過處理后加入蛋白裂解液裂解蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度為1μg/μL，加入溴酚藍(lán)后于100℃金屬浴煮10min 使蛋白變性。吸取20μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白凝膠電泳，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、5%牛奶封閉后，于4℃過夜孵育對(duì)應(yīng)一抗，次日洗去一抗后室溫孵育化學(xué)二抗1h，洗去二抗后使用化學(xué)發(fā)光掃膜儀進(jìn)行成像分析。

1.9 MTT 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染siRNA 24h 后，利用胰酶消化離心，利用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至5×104/mL。將細(xì)胞以1 萬/孔鋪板于96 孔板中，分別于0、48h 加入10μL MTT。MTT 加入2h 后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)基吸光度值，計(jì)算其相對(duì)吸光度值。

1.10 細(xì)胞遷移檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 24h 后，利用胰酶消化離心，利用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至5×105/mL。取100μL/孔加入到transwell 上室中，下室加入600μL 培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24h，24h 后取出細(xì)胞利用4%多聚甲醛固定，擦去上室未遷移的細(xì)胞后，利用結(jié)晶紫染色，在光學(xué)顯微鏡下拍照，計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織VEGF 表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，41份肝癌組織標(biāo)本中，VEGF 表達(dá)陽性29 份，陽性率70.73%（29/41），主要表現(xiàn)為細(xì)胞漿或細(xì)胞膜棕褐色著色，41 份癌旁組織中染色VEGF 表達(dá)陽性3 份，陽性率30.00%（3/10），正常肝組織均未見VEGF 陽性表達(dá)。肝癌組織VEGF 表達(dá)陽性率顯著高于癌旁肝組織和正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.01）；肝癌組織VEGF 表達(dá)與腫瘤分化程度有關(guān)，病理分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)明顯高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)（P＜0.05）；還與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移性有關(guān)，高侵襲轉(zhuǎn)移明顯高于低侵襲轉(zhuǎn)移（P＜0.05）；與血清AFP 水平及HBV 無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

2.2 VEGF 對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 生物學(xué)過程的影響在HepG2 細(xì)胞內(nèi)分別轉(zhuǎn)染VEGF siRNA 或其陰性對(duì)照物，MTT 檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染VEGF siRNA 抑制VEGF 表達(dá)后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表3）。進(jìn)一步采用Western blot 檢測(cè)細(xì)胞關(guān)鍵蛋白表達(dá)改變情況，結(jié)果顯示，抑制VEGF 表達(dá)后，細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)顯著下調(diào)，細(xì)胞凋亡蛋白Bax 表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Transwell遷移試驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，抑制VEGF的表達(dá)后，HepG2 細(xì)胞遷移能力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

表2 VEGF 蛋白表達(dá)與肝癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

表3 轉(zhuǎn)染VEGF siRNA 后對(duì)細(xì)胞增殖的影響（%，）

注：VEGF siRNA（-）為VEGF siRNA 陰性對(duì)照物；VEGF siRNA（+）為VEGF siRNA；與本組0h 比較，aP＜0.05；與VEGF siRNA（-）48h 比較，bP＜0.05

圖1 VEGF 對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 生物學(xué)過程的影響（結(jié)晶紫染色100×）

2.3 肝癌細(xì)胞株miR-29 表達(dá)及與VEGF 的關(guān)系qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，LO2 正常人肝細(xì)胞系miR-29 表達(dá)較高，HepG2 人肝癌細(xì)胞miR-29 表達(dá)異常降低（P＜0.05）（見表4）；轉(zhuǎn)染miR-29 mimics 促進(jìn)miR-29 表達(dá)后，VEGF mRNA 水平和蛋白質(zhì)水平均顯著降低（P＜0.05）（見表5、圖2）。

圖2 miR-29 在肝癌細(xì)胞株表達(dá)及與VEGF 的關(guān)系

表4 LO2 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞miR-29 表達(dá)比較（）

表4 LO2 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞miR-29 表達(dá)比較（）

注：miR-29 為微小RNA-29；與正常人肝癌細(xì)胞LO2 比較，aP＜0.05

2.4 姜黃素對(duì)肝癌細(xì)胞抑制效應(yīng) MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增加，作用時(shí)間延長，姜黃素對(duì)HepG2 細(xì)胞的抑制率也明顯增加，72h 抑制率最好，方差分析結(jié)果顯示，五種濃度姜黃素對(duì)細(xì)胞抑制率有顯著差異性（F=73.213，P＜0.05），當(dāng)姜黃素濃度為59.68μmol/L 時(shí)（接近中效濃度），72h 抑制率達(dá)54.93%。根據(jù)中效方程式計(jì)算出72h 的中效濃度IC50 為49.50μmol/L。見表6。

表5 轉(zhuǎn)染miR-29 后對(duì)VEGF mRNA 的影響（）

表5 轉(zhuǎn)染miR-29 后對(duì)VEGF mRNA 的影響（）

注：miR-29 為微小RNA-29；VEGF 為血管內(nèi)皮生長因子；miR-29 mimics（-）為miR-29 mimics 陰性對(duì)照；mimics 為模擬物；與轉(zhuǎn)染miR-29 mimics（-）組比較，aP＜0.05

表6 不同濃度姜黃素對(duì)HepG2 細(xì)胞抑制率比較（%，）

表6 不同濃度姜黃素對(duì)HepG2 細(xì)胞抑制率比較（%，）

注：與24、48h 比較，aP＜0.05

2.5 姜黃素對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞miR-29 及VEGF mRNA 表達(dá)的影響 在肝癌HepG2 細(xì)胞內(nèi)添加姜黃素59.68umol/L 作用72h 后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-29 和VEGF 表達(dá)情況，與試劑對(duì)照組比較，姜黃素組miR-29 表達(dá)顯著升高，VEGF mRNA 表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05），見表7、圖3。

圖3 姜黃素對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞VEGF mRNA 表達(dá)的影響

表7 姜黃素對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞miR-29及VEGF mRNA 表達(dá)的影響（）

表7 姜黃素對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞miR-29及VEGF mRNA 表達(dá)的影響（）

注：miR-29 為微小RNA-29；VEGF 為血管內(nèi)皮生長因子；與試劑對(duì)照組比較，aP＜0.05

3 討論

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）具有發(fā)展快、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后極差等特點(diǎn)，臨床難點(diǎn)主要在于早期診斷率低，術(shù)前難以確定有無微小轉(zhuǎn)移等。VEGF 是腫瘤新生血管生成的重要調(diào)控因素之一[9-11]。研究顯示，肝癌細(xì)胞內(nèi)VEGF 異常表達(dá)對(duì)于肝癌的發(fā)生發(fā)展可能存在重要意義，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[12-14]。

本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，肝癌組織VEGF 陽性率顯著增加。進(jìn)一步研究VEGF 異常表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)過程的影響，VEGF 異常高表達(dá)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和遷移，抑制細(xì)胞凋亡；轉(zhuǎn)染siRNA 抑制VEGF 表達(dá)后，細(xì)胞增殖降低，遷移減少，凋亡增加。提示異常高表達(dá)的VEGF 對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)影響顯著，而逆轉(zhuǎn)VEGF 表達(dá)可能直接影響肝癌細(xì)胞生物學(xué)過程。

MicroRNAs（miRNAs）是一類小的、進(jìn)化高度保守的、內(nèi)源性非編碼RNA 分子，可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)調(diào)控多種基因表達(dá)。隨著表觀遺傳學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在許多重要的生物學(xué)過程包括細(xì)胞周期、分化、發(fā)育和新陳代謝方面發(fā)揮著重要作用[15-17]。文獻(xiàn)報(bào)道，miR-29 與VEGF 可能存在上下游關(guān)系[18-20]，提示在肝癌細(xì)胞內(nèi)，VEGF 異常表達(dá)可能與miR-29 密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞VEGF 異常高表達(dá)，miR-29 表達(dá)顯著低于正常肝細(xì)胞；轉(zhuǎn)染miR-29mimics 促進(jìn)miR-29 表達(dá)后，VEGF 表達(dá)顯著降低，提示肝癌HepG2 細(xì)胞，VEGF 異常表達(dá)與miR-29 相關(guān)聯(lián)，miR-29 可能發(fā)揮VEGF siRNA 的作用，調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞生物學(xué)過程。miR-29 可能作為逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞異常生物學(xué)過程的潛在靶基因。

姜黃素（curcumin）是姜黃的主要活性成分之一。多項(xiàng)研究表明，姜黃素抗癌譜廣，毒副作用小，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的抗癌新藥[21-23]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)姜黃素濃度為59.68μmol/L 時(shí)（接近中效濃度），對(duì)肝癌細(xì)胞72h 抑制率達(dá)54.93%，IC50 為49.50μmol/L。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞與姜黃素共同培養(yǎng)時(shí)，肝癌細(xì)胞miR-29 表達(dá)顯著升高，同時(shí)VEGF 表達(dá)下降，提示姜黃素可在某種程度上促進(jìn)肝癌細(xì)胞miR-29 表達(dá)，進(jìn)而抑制VEGF 表達(dá)，調(diào)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)過程。

綜上所述，姜黃素可顯著促進(jìn)肝癌HepG2 細(xì)胞miR-29 表達(dá)，上調(diào)VEGF 表達(dá)，影響肝癌細(xì)胞生物學(xué)過程。但是VEGF 調(diào)控肝癌細(xì)胞的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。