楊云輝

(福建省漁業(yè)資源監(jiān)測中心，福建 福州 350003)

作者簡介：楊云輝(1987-)，男，助理工程師，研究方向：水產(chǎn)品質(zhì)量安全.E-mail：492836730@qq.com

近年來，受氣候變化和陸源污染等因素影響，有毒赤潮在全球范圍內(nèi)呈逐年增加的趨勢[1]。當海洋中的貝類大量濾食這些有毒藻類時，毒素便會在貝類體內(nèi)積累和放大并轉化為貝類毒素[2]。這種毒素可能對貝類本身不帶來傷害，卻可以通過食物鏈在人體中得以釋放，使食用者產(chǎn)生相應的中毒癥狀，危害人體健康，甚至威脅生命安全。其中麻痹性貝類毒素(Paralytic shellfish toxins，PSTs)在每年全球由貝類毒素引起的中毒事件中所占的比例達87%，是全球分布最廣、事故發(fā)生率最高、危害程度最大的一類毒素[3]。

福建沿海作為我國赤潮高發(fā)區(qū)之一，僅2012年至2018年7月就發(fā)生赤潮56起，其中有毒赤潮19起[4]。2017年6月，福建南部到中部沿海發(fā)現(xiàn)有毒赤潮，多個地區(qū)在貝類中檢出麻痹性貝類毒素，多人因誤食這些帶PST毒素的貝類中毒而就醫(yī)。頻頻發(fā)生的貝類毒素中毒事件，不僅影響了海水貝類產(chǎn)業(yè)，還帶來了十分嚴峻的食品安全問題。為避免含有染毒貝類流入市場，在有毒赤潮高發(fā)期，對沿海各地的貝類毒素進行快速有效的篩查尤為必要。

HPLC-MS/MS法作為最具潛力的檢測技術，目前在海洋生物毒素的檢測分析領域已表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢[5]。該方法幾乎可以分析檢測目前已確定化學結構的貝類毒素，并且可對目標毒素進行單獨篩選和檢測，分析速度快、靈敏度高，具有很好的重現(xiàn)性[6-10]。本實驗使用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀)對2017—2018年期間從福建沿海各地采集的60批次不同品種的貝類進行PST毒素定量分析檢測，分離鑒定8種PST毒素，為福建省沿海麻痹性貝類毒素成分研究以及今后的風險評估工作積累基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

2017年5月至2018年7月于福建中部海域各養(yǎng)殖區(qū)采集的牡蠣、貽貝、縊蟶、菲律賓蛤仔等樣品，共計60批次(-20℃冷凍保存)，如表1所示。

表1 樣品分布情況Tab.1 The distribution of the sample 單位：批次Unit：batch

1.2 儀器與試劑

Triple Quad 5500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX 公司)；Genius ABN2ZA氮氣發(fā)生器(英國Peak公司)；3-30K高速離心機(德國Sigma 公司)；N-EVAP-24氮吹儀(美國0rganomation公司)；Milli-Q Integral 5超純水一體化智能系統(tǒng)(美國 Millipore公司)；SL-502N分析天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；KQ-600DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS3 DS25渦旋振蕩器(德國IKA 公司)等。

甲酸(色譜純美國TEDIA 公司)；乙腈(色譜純德國MERCK 公司)；乙酸乙酯(色譜純 MERCK 公司)；三氯甲烷(分析純國藥集團化學試劑有限公司)；甲醇(譜純MERCK公司)；GTX1/4標準溶液(24.8 μg/mL & 8.1 μg/mL上海安譜科學儀器有限公司)；GTX2/3標準溶液(45.2 μg/mL & 17.2 μg/mL上海安譜)；dcGTX2/3標準溶液(40.9 μg/mL & 9.2 μg/mL上海安譜)；GTX5標準溶液(21.1 μg/mL上海安譜)；STX標準溶液(24.7 μg/mL上海安譜)；dcSTX標準溶液(21.4 μg/mL上海安譜)。

1.3 實驗材料

HLB固相萃取柱(美國Waters公司)：3 mL/60 mg，使用前依次用6 mL甲醇、6 mL水和6 mL甲酸溶液(0.5%)活化。

1.4 實驗方法

實驗采用高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法檢測PSTs。

1.4.1 提取

稱取5 g試樣，置于50 mL塑料離心管中，加入5 mL甲酸溶液(0.5%)，3 000 r/min渦旋1 min，超聲提取5 min，10 000 r/min離心10 min，移出上清液，殘渣再加入4.5 mL甲酸溶液(0.5%)重復提取兩次，合并3次上清液加甲酸溶液(0.5%)定容至15 mL(參照“GB 5009.213—2016《食品安全國家標準 貝類中麻痹性貝類毒素的測定》”方法)。

1.4.2 凈化

提取液中加入20 mL乙酸乙酯，渦旋混勻30 s，10 000 r/min離心10 min，棄去上層溶液；加入20 mL三氯甲烷，3 000 r/min渦旋混勻30 s，10 000 r/min離心10 min；取3 mL上層溶液加入已活化的固相萃取柱中(1滴/s)，收集流出液至刻度離心管，再加入1 mL甲酸溶液(0.5%)，收集流出液至3.5 mL；加入4.5 mL乙腈，混勻后放置5 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液超濾膜過濾供HPLC-MS/MS儀器分析，所得1 mL濾液相當于0.125 g樣品。

1.4.3 液相色譜條件

色譜柱：HILIC-A柱，柱長50 mm，內(nèi)徑2.1 mm，粒徑3 μm；

流動相：流動相A為甲酸溶液(0.1%)，流動相B為乙腈(Acetonitrile)，梯度洗脫條件見表2；

表2 流動性梯度洗脫條件Tab.2 Gradient elution conditions

柱溫：30℃；進樣量：2.0 μL。

1.4.4 質(zhì)譜分析條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；

掃描方式：正離子掃描；

監(jiān)測方式：多反映監(jiān)測模式，麻痹性貝類毒素的母離子、子離子和碰撞能量見表3；

表3 PSTs監(jiān)測離子及碰撞能量Tab.3 The monitoring ion and collision energy of PSTs

電噴霧電壓：5 500 V；

離子源溫度：500℃；

氣簾氣壓力：35.0 psi；

碰撞氣壓力：7 psi；

霧化氣壓力GS1：50.0 psi；

輔助加熱氣壓力GS2：50.0 psi。

2 結果

2.1 分析性能的研究

2.1.1 離子色譜圖

由于PSTs結構與極性相近，出峰時間較為集中，幾種PSTs均在1.85～1.92 min時間內(nèi)出峰，如圖1所示。其中GTX1/4、GTX2/3以及dcGTX2/3毒素又互為同分異構體，極性差異性小，實驗過程中未能很好地分離，未能分開定量，所以測定時對這3組PST毒素進行加和計算。

2.1.2 標準曲線

由于貝類樣品的基質(zhì)較為復雜，為減少基質(zhì)中其他雜質(zhì)的干擾，減小影響，采用空白貽貝配制混合標準基質(zhì)液，繪制基質(zhì)匹配標準曲線。選用不含麻痹性貝類毒素的貽貝，按照與檢測樣品相同的操作步驟，得到空白貽貝基質(zhì)液，并分別加入混合標準中間液，配制濃度梯度(以STX計)為10、20、40、50、100、200 ng/mL的混合標準工作液。以各目標化合物的質(zhì)量溶度為橫坐標(x)，定量離子的峰面積為縱坐標(y)，進行線性回歸分析。各PSTs基質(zhì)線性范圍、線性方程及相關系數(shù)見表4。結果顯示，在10.0～200.0 ng/mL范圍內(nèi)各麻痹性貝類毒素的線性關系良好，相關系數(shù)R2均大于0.997。

表4 PSTs線性范圍、線性方程及相關系數(shù)Tab.4 The liner range，linear equation and correlation coefficient of PSTs

2.1.3 回收率、精密度和檢出限

在空白樣品中，加入PST毒素標準溶液，每個添加水平平行測試6次。實驗結果表明，9種PST毒素的平均回收率在78.9%～89.7%之間，相對標準偏差(RSD)在1.5%～9.5%之間，方法的穩(wěn)定性和準確度滿足微分分析的要求。根據(jù)信噪比(S/N≥3)計算各目標化合物檢出限，以信噪比(S/N≥10)計算各目標化合物定量限，測定計算結果見表5。

表5 貝類基質(zhì)中添加PSTs的回收率和精密度(n=6)Tab.5 The recovery rate and precision of PST added in to the substrate of shellfish(n=6)

2.2 PSTs毒素檢測結果

實驗通過HPLC-MS/MS法檢測4類60批次貝類樣品中，檢出PSTs毒素的樣品17批次(檢測結果見表6)，均為2017年采集的貝類樣品，其中：牡蠣4批次、貽貝13批次，縊蟶和蛤類樣品均未檢出；2018年采集的貝類樣品均未檢出PSTs毒素。檢測的9種目標化合物中：dcSTX毒素檢出頻次最高，在17批次樣品中檢出，其中2批次小于定量限；檢出GTX1/4毒素的樣品5批次，均小于定量限；檢出GTX2/3毒素的樣品2批次，其中1批次小于定量限；檢出GTX5毒素的樣品4批次；檢出dcGTX2/3毒素的樣品3批次，其中2批次小于定量限；STX毒素均未檢出。

表6 陽性樣品PSTs含量Tab.6 The results of PSTs from positive samples μg/kg

3 討論

3.1 福建海域PSTs毒素的主要構成

結果顯示，2017年福建中部海域貝類養(yǎng)殖區(qū)麻痹性貝類毒素主要成分為脫氨甲?；扛蚨舅?dcSTX、100%)、膝溝藻毒素(GTX1/4、29.4%)、膝溝藻毒素(GTX5、23.5%)、脫氨甲?；显宥舅?dcGTX2/3、17.6%)、膝溝藻毒素(GTX2/3、11.8%)，尚未發(fā)現(xiàn)石房蛤毒素(STX)；不同養(yǎng)殖區(qū)間的貝類毒素成分和含量雖有差異，但大體上比較相似。牡蠣體中PSTs的主要成分有dcSTX、dcGTX2/3、GTX5、GTX1/4，貽貝體中PSTs的主要成分為dcSTX、dcGTX2/3、GTX5、GTX1/4、GTX2/3，由于牡蠣和貽貝生長環(huán)境相似，其PST毒素成分差異性不大。

與其他一些學者的研究結果相吻合，如王旭峰等[11]在深圳大鵬澳海域的翡翠貽貝中檢出GTX2、GTX3、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2等8種毒素；張卓[12]等在深圳大鵬澳海域牡蠣中檢出dcSTX、GTX1、GTX4、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、NEO、C1和C2等9種，未檢出STX。

3.2 麻痹性貝類毒素的來源

本次實驗中檢測出PSTs貝毒的貝類樣品均采自2017年6—9月福建省中部海域，根據(jù)相關報道[13]，2017年6月在福建省泉州海域發(fā)生鏈狀裸甲藻赤潮，同時在莆田和平潭海域也檢測出低密度鏈狀裸甲藻，相關貝類質(zhì)量安全監(jiān)管跟蹤監(jiān)測顯示，直至9月5日泉州海域養(yǎng)殖貝類才連續(xù)2周未檢出PSTs貝毒。鏈狀裸甲藻赤潮發(fā)生時間以及PSTs貝毒監(jiān)測結果與本實驗樣品采集時間和檢測結果相似，由此推測2017年養(yǎng)殖貝類樣品中所檢測出的麻痹性貝毒可能來自于2017年在福建省中部海域發(fā)生的鏈狀裸甲藻赤潮。相關研究表明，鏈狀裸甲藻可產(chǎn)生PSTs毒素[14-16]，其主要產(chǎn)毒成分為C1、C2、GTX5、dcGTX2、dcGTX 3和dcSTX[17-18]。本次實驗檢測出的麻痹性貝毒主要成分為dcSTX、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcGTX2和dcGTX3，與鏈狀裸甲藻產(chǎn)毒成分相似。同時貝類對藻類有濾食作用，可在體內(nèi)富集藻類毒素，因此鏈狀裸甲藻應是2017年福建中部海域麻痹性貝類毒素的主要影響因素。

3.3 不同貝類PSTs的差異

2017年樣品中牡蠣和貽貝檢測出PSTs貝毒，但縊蟶和蛤類樣品中未檢出?？梢姴煌愵悓τ赑STs毒素的富集作用不同。南日島附近海域于2017年6月11日發(fā)現(xiàn)鏈狀裸甲藻，最高細胞密度1.4×105個/L，養(yǎng)殖區(qū)牡蠣體內(nèi)PSTs毒素由62.7 μg/kg(第1天)→ 131.3 μg/kg(第2天)→ 144.2 μg/kg(第3天)→ ND(第4天)→ ND(第5天)。說明牡蠣能第一時間將周邊環(huán)境中鏈狀裸甲藻濾食進體內(nèi)，體內(nèi)PSTs毒素開始富集，隨著環(huán)境中鏈狀裸甲藻密度降低，體內(nèi)PSTs毒素富集趨勢減緩，開始被迅速消解。而海壇島北部海域于2017年6月15日檢出有低密度的鏈狀裸甲藻，最高細胞密度為3.3×103個/L，養(yǎng)殖區(qū)貽貝體內(nèi)PSTs毒素由486.3 μg/kg(第3天)→280.4 μg/kg(第5天)→116.4 μg/kg(第8天)→73.1 μg/kg(第12天均值)→65.6 μg/kg(第15天均值)→65.7 μg/kg(第19天)。說明隨著時間推移，貽貝體內(nèi)PSTs毒素含量逐漸降低，但相比牡蠣，貽貝對PSTs毒素的消解能力較弱。由此可見不同貝類對PST毒素的消解能力具有明顯的差異。崇武至深滬海域于2017年6月6日發(fā)現(xiàn)鏈狀裸甲藻赤潮(赤潮基準密度：5×105個/L)，最高細胞密度1.79×106個/L，最大影響面積13.2 km2，于6月13日消退，鏈狀裸甲藻爆發(fā)持續(xù)時間超過12 d。直至2017年9月5日，崇武至深滬海域養(yǎng)殖貽貝體內(nèi)仍能檢出較大量的PSTs毒素(183.3 μg/kg)。對比海壇島貽貝實驗結果發(fā)現(xiàn)，海域中鏈狀裸甲藻密度越高、赤潮持續(xù)時間越長，對養(yǎng)殖貝類的影響越大，麻痹性貝類毒素在貝類體中存在的時間越久，對貽貝食用安全的風險也越大。