王 磊，喬 琨

(1.廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建 廈門 361102；2.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013)

赤潮(Red tide)，是由于海域環(huán)境的改變，導(dǎo)致某些單細(xì)胞浮游生物暴發(fā)性繁殖，引起水色異常的生態(tài)現(xiàn)象[1]，是全球性海洋災(zāi)害之一。近年來(lái)，我國(guó)近岸海域赤潮暴發(fā)越來(lái)越頻繁，赤潮暴發(fā)呈現(xiàn)發(fā)生面積廣、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)[2-3]。僅2012年福建和浙江沿海就發(fā)生17起赤潮，其中米氏凱倫藻赤潮14起，赤潮范圍從北到南貫穿全省，面積累計(jì)643 km2，導(dǎo)致貝類尤其是鮑魚大規(guī)模死亡，造成直接經(jīng)濟(jì)損失約20億[4]。研究赤潮發(fā)生的機(jī)制，探索預(yù)警、預(yù)報(bào)乃至防治的方法已成為擺在海洋學(xué)家面前的一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的課題[5]。因此，如何快速準(zhǔn)確地檢測(cè)有害赤潮藻的種類和動(dòng)態(tài)變化成為重要研究?jī)?nèi)容。

傳統(tǒng)的藻類鑒定是以形態(tài)特征為依據(jù)的顯微鏡檢測(cè)技術(shù)，也是目前將浮游植物鑒定到種的既直觀又可靠的途徑。此法要求使用者具有很高的藻類分類學(xué)專業(yè)基礎(chǔ)，同時(shí)又耗時(shí)，難以滿足快速及大批量的鑒定需求。運(yùn)用圖像識(shí)別技術(shù)可以進(jìn)行浮游植物種類的識(shí)別，但該方法由于儀器昂貴，難于普及[6]。流式圖像技術(shù)受制于對(duì)浮游植物粒級(jí)結(jié)構(gòu)全面性的限制，僅適合于微型浮游植物的研究如原綠球藻、藍(lán)細(xì)菌等。此外，流式細(xì)胞儀不僅價(jià)格昂貴，操作也相對(duì)復(fù)雜[7]。分子探針技術(shù)在海洋浮游植物種類識(shí)別研究中已開(kāi)始逐步展開(kāi)，海洋學(xué)家嘗試?yán)梅肿邮侄螌?duì)其進(jìn)行分類鑒定及系統(tǒng)學(xué)研究，但其只能針對(duì)特定種類進(jìn)行定性定量研究，也并不適合常規(guī)的浮游植物種類鑒定工作[8]。

藻類化學(xué)分類法，是一種以色素為基礎(chǔ)，利用不同類群浮游植物色素組成和含量的特異性差異，通過(guò)高效液相色譜技術(shù)，結(jié)合計(jì)算色素比值矩陣的CHEMTAX方法，可以得到研究海域浮游植物的類群組成特征。利用HPLC技術(shù)分析浮游植物的色素組成用以估算不同類別浮游植物的方法，得到全球各地海洋研究者的廣泛認(rèn)可[9-10]。國(guó)內(nèi)的研究中，王海黎等首先建立了應(yīng)用高效液相色譜的提取分離分析光合色素方法[11]；焦念志等利用HPLC確認(rèn)了原綠球藻在中國(guó)南海和東海的存在[12]；陳繼新等開(kāi)展了廈門灣、東海和南海北部的浮游植物群落結(jié)構(gòu)的研究[13]；黃邦欽等進(jìn)一步將該方法應(yīng)用到南海、黃海等海域浮游植物群落分布的研究[14-15]。但藻類中的色素組成非常復(fù)雜：不同門類的藻類色素差別極大，即使是同一種不同亞株，其色素的含量亦有差異，利用CHEMTAX計(jì)算出來(lái)的結(jié)果僅能得到浮游植物類群結(jié)構(gòu)及各個(gè)色素的濃度，無(wú)法對(duì)藻類進(jìn)一步定性。因此，在藻類化學(xué)分類法初步定性確定藻類的群落后，再利用傳統(tǒng)分類法進(jìn)一步鑒定，為快速檢測(cè)常見(jiàn)赤潮優(yōu)勢(shì)種群提供了豐富的理論依據(jù)和可行性。

1 材料與方法

1.1 藻株分離與培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自于2015至2018年間，廈門、莆田、東山、泉州等海域赤潮暴發(fā)現(xiàn)場(chǎng)采集的水樣。對(duì)樣品中赤潮藻類種群進(jìn)行篩選及單克隆純化，并于光鏡下對(duì)赤潮優(yōu)勢(shì)種進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行純種培養(yǎng)至穩(wěn)定期，采用顧海峰等[16]藻類形態(tài)學(xué)和分子鑒定技術(shù)對(duì)純種株系進(jìn)行鑒定。即采用蔡司Axio Imager A2正置顯微鏡拍攝光鏡(LM)圖片，對(duì)無(wú)法使用光鏡鑒定的種類，利用掃描電鏡(SEM)技術(shù)進(jìn)行形態(tài)分析。同時(shí)運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)(18S和ITS)對(duì)藻類進(jìn)行分子鑒定。先后得到血紅哈卡藻、東海原甲藻、米氏凱倫藻、塔瑪亞歷山大藻、膝溝藻等10株純種赤潮藻類及2株純種綠藻(圖1)。

1.2 光合色素分析

1.2.1 樣品預(yù)處理

在負(fù)壓不超過(guò)200 mm Hg的條件下，將純培養(yǎng)至穩(wěn)定期的樣品過(guò)濾到直徑為25 mm的GF/F濾膜(Whatman)上。過(guò)濾后將濾膜對(duì)折后用鋁箔袋封裝，立即保存到-80℃超低溫冰箱等待測(cè)定。樣品冷凍干燥后，將膜樣轉(zhuǎn)移至2 mL棕色離心管內(nèi)，加入1 mLN，N-二甲基甲酰胺作為提取劑，在-20℃冰箱中避光萃取1 h，間或振蕩1～2次，后將萃取液的上清液用0.45 μm的濾膜過(guò)濾。取濾液與1 mol/L乙酸銨等體積充分混合于1.5 mL色譜瓶中待HPLC分析，整個(gè)處理過(guò)程需在低溫低光條件下進(jìn)行。

1.2.2 光合色素的HPLC檢測(cè)

HPLC的分析系統(tǒng)為戴安Ulti-Mate 3 000 LC液相色譜工作站。借助二極管陣列檢測(cè)器(DAD)檢測(cè)洗脫峰，固定記錄波長(zhǎng)為440 nm和663 nm的值，同時(shí)記錄300～800 nm的吸收光譜以便作定性分析。色譜柱采用Eclipse-XDB C8。流動(dòng)相A為1∶4的100%甲醇∶1 mol/L乙酸銨混合液，流動(dòng)相B為100%甲醇。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 高效液相色譜光合色素分離分析梯度洗脫程序表Tab.1 The gradient elution procedures of photosynthetic pigments for HPLC analysis

參照文獻(xiàn)[17-18]提供的光合色素掃描圖譜，根據(jù)光合色素洗出峰的保留時(shí)間(tR)和吸收光譜(300～800 nm)特征進(jìn)行定性。由于進(jìn)行色譜分析時(shí)梯度洗脫液的配制與文獻(xiàn)[19]所用不盡相同，各光合色素的保留時(shí)間與文獻(xiàn)值有所差異，有一些光合色素的最大吸收峰與文獻(xiàn)提供值存在2～4 nm差異。光合色素定量采用外標(biāo)法，光合色素標(biāo)準(zhǔn)樣品由黃邦欽教授課題組提供，所有標(biāo)樣均采購(gòu)自 DHI公司。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

對(duì)不同藻株的光合色素進(jìn)行聚類分析(Average Linkage組間聚類分析)。相關(guān)的統(tǒng)計(jì)和作圖采用MSExcel 2012和SPSS(SPSS11.0，2001)等軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素組成及占比分析

12株藻類光合色素組成見(jiàn)表2，葉綠素a在全部樣品中均有檢出，β-胡蘿卜素除6號(hào)(海洋卡盾藻)外，其余均有檢出。其他五種色素，因種屬差異，亦有明顯不同。葉綠素c1+c2在10株藻中都有檢出，而在3號(hào)(亞心形扁藻)和4號(hào)(卵囊藻)中未檢出；3號(hào)和4號(hào)屬于綠藻門，而新黃素作為青綠藻、綠藻的特征色素，在這兩株藻中均有檢出；屬于甲藻的1、5(東海原甲藻)、7、8、9、10號(hào)樣品中均檢測(cè)出多甲藻素，而其他編號(hào)樣品均未檢出；作為硅藻特征色素之一的巖藻黃素在2號(hào)(中肋骨條藻)和12號(hào)(角毛藻)樣品中均有檢出。結(jié)果表明，不同門的藻株在光合色素組成差異明顯。藍(lán)藻含藻青蛋白和藻紅蛋白，硅藻含葉綠素a、c、硅藻素和胡蘿卜素，甲藻富含葉綠素a、葉綠素c、β-胡蘿卜素和四種葉黃素，著色鞭毛藻具有胡蘿卜素(黃色/褐色色素)等[20]。根據(jù)這些特征色素，可以實(shí)現(xiàn)藻株的門類區(qū)分。

表2 HPLC方法測(cè)定的赤潮藻株主要光合色素濃度百分比組成表Tab.2 Percentage of the main photosynthetic pigments of 12 species determined by HPLC %

同時(shí)，這些藻類除了在光合色素組成上存在很多差異外，光合色素的濃度比例也表現(xiàn)出種類的差異，如多甲藻素在各株甲藻的色素占比較大，5號(hào)(東海原甲藻)的多甲藻素含量占比最高達(dá)30.1%，而1號(hào)(血紅哈卡藻)的多甲藻素含量占比僅為17.1%；綠藻門的特征色素新黃素，在3號(hào)(亞心形扁藻)的色素含量占比20.8%，而在4號(hào)(卵囊藻)中僅占3.4%；而作為硅藻特征色素之一的巖藻黃素在2號(hào)(中肋骨條藻)和12號(hào)(角毛藻)中含量均較高，占比達(dá)40%以上，而在其他三種藻株的含量均低于30%。以上表明，在根據(jù)特征色素對(duì)藻株進(jìn)行門類區(qū)分的基礎(chǔ)上，可以根據(jù)特征色素和非特征色素的含量高低，對(duì)同一門內(nèi)藻株進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分。

將12株藻進(jìn)一步通過(guò)CHEMTAX程序因子分析方法對(duì)其特征光合色素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，12株藻被分為甲藻(1、5、7、8、9、10)、硅藻(2、12)、綠藻(3、4)及定鞭藻(6、11)四個(gè)類群。

2.2 色素組成比聚類分析

為了更好地反映光合色素組成和濃度比例上的關(guān)系，將表2中的色素濃度結(jié)果進(jìn)行了聚類分析[21-22]，圖3的結(jié)果顯示了用不同光合色素比例進(jìn)行區(qū)分的各種藻的相互關(guān)系。聚類的結(jié)果較好地將12株樣品分類出甲藻(1、5、7、8、9、10)、硅藻(2、12)、綠藻(3、4)及著色鞭毛藻(6、11)等4個(gè)分支。從聚類的結(jié)果可以看出，甲藻門下的錐狀斯克里普藻和膝溝藻有較近的親緣關(guān)系，而東海原甲藻與其他幾株甲藻門生物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。海洋卡盾藻和球形棕囊藻屬于著色鞭毛藻類而單獨(dú)形成支。這個(gè)結(jié)果與CHEMTAX、形態(tài)及分子鑒定數(shù)據(jù)一致。

3 討論

本研究結(jié)果表明，不同的藻類具有不同的特征光和色素，通過(guò)運(yùn)用高效液相色譜技術(shù)可以準(zhǔn)確定性藻類色素種類，并實(shí)現(xiàn)不同藻類的類群分類，以及藻類門、綱水平的分類。并且，通過(guò)HPLC技術(shù)能夠進(jìn)行快速、大量的現(xiàn)場(chǎng)樣品測(cè)定，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類法耗時(shí)的不足。在傳統(tǒng)分類方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合高效液相色譜法，根據(jù)其特征色素可以進(jìn)行藻類門類區(qū)分。根據(jù)特征色素的組成，可以對(duì)藻類進(jìn)行不同門類的區(qū)分，同時(shí)根據(jù)特征色素的濃度含量比例，還可進(jìn)行同門內(nèi)種屬區(qū)分。藻類化學(xué)分類法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類學(xué)上遇到種類差別細(xì)微造成主觀誤判的不足。