張芹，孔令軍，屈長義，馮建新

(1. 河南省水產科學研究院， 河南 鄭州 450044； 2.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院， 河南 鄭州 450002)

團頭魴(Megalobramaamblycephala)含肉率高，肉味鮮美，是中國池塘養(yǎng)殖的主要品種。團頭魴自然分布非常狹窄，主要分布在湖北省梁子湖、淤泥湖以及江西省鄱陽湖，目前團頭魴選育中基礎群體的原種大部分來源于以上三個湖泊中[1-2]。伊河為黃河支流，歷史上早已有關于伊河魴的記載。“伊河魴”在分類上屬于魴屬團頭魴，是近年來選育出來的一個優(yōu)良新品系[3]，梁子湖盛產素有“武昌魚”美稱的團頭魴，是人工養(yǎng)殖團頭魴苗種的一個主要來源，本研究通過對產于長江流域的梁子湖團頭魴和黃河流域的伊河團頭魴兩個群體進行對比，希望找到兩個群體團頭魴之間的差異，為團頭魴的選育和伊河團頭魴的種質保護提供技術支持。

同工酶作為重要的分子標記物，在遺傳學、育種學、生理學及分類學等生命科學學科中有著廣泛的應用[4-5]。同工酶技術可以從蛋白質水平上顯示種質資源的遺傳多樣性，通過分析同工酶的不同譜帶，可以鑒定同一物種不同種質之間的遺傳差異[6]，也可作為研究不同種質之間親緣關系的一種方法，酶譜越相近，物種親緣關系也越相近[7]。同工酶在水產動物上主要用來研究親緣關系、鑒定物種分類，是一種重要的遺傳標記[8]，和其他種質鑒定技術相比，同工酶技術由于不受環(huán)境條件制約，鑒定速度快且相對經濟[6,9]，應用較為廣泛。

本研究采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對兩個群體團頭魴5種組織中的乳酸脫氫酶(LDH)和酯酶(EST)同工酶的表達進行了研究，分析2個群體團頭魴之間同工酶酶譜的差異，旨在了解不同組織中2種同工酶表達的相似性和差異性，篩選出伊河團頭魴的特征生化遺傳參數，為其種質標準的制定和種質資源鑒定提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

團頭魴群體為池塘養(yǎng)殖群體，伊河團頭魴于2016年10月采自河南省嵩縣伊河魴育種中心，共30尾，體重為(823.80±85.74)g，體長為(372.30±19.85)cm；梁子湖團頭魴于2016年10月采自湖北省鄂州市國家級團頭魴原種場，共30尾，體重為(720.20±74.59)g，體長為(355.00±17.88)cm。

1.2 形態(tài)測定

伊河團頭魴形態(tài)的測定按照GB/T 18654.3—2008《養(yǎng)殖魚類種質檢驗》中的相關規(guī)定進行，用游標卡尺(精確度0.1 mm)對樣品進行測定。

1.3 組織酶液的制備

隨機選擇2個群體的團頭魴各8尾，尾靜脈采血，4 ℃冰箱保存4 h，析出血清。將實驗魚在水中剪鰓放血后，迅速解剖取眼睛、肌肉、心臟和腎臟等組織，整個實驗過程在冰浴條件下完成，以減少實驗魚的痛苦。取出后的組織用4 ℃生理鹽水洗凈，同析出的血清一起存放于-70 ℃超低溫冰箱中保存。

按1∶10(m/v)的比例加入預冷的0.2 mol/L (pH 7.4)磷酸鹽緩沖液，冰浴條件下勻漿并分裝于離心管中，每個離心管中加入0.8 mL 組織勻漿液，0.4 mL 氯仿，振蕩混勻。離心(4 ℃，5 000 r/min)5 min，取上清液分裝后放于-70 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。電泳時，將上清液和染色劑按照5∶1(V/V)的比例混勻上樣，制備好的血清可直接和染色劑按照5∶1的比例混勻后使用。

1.4 電泳和染色

采用聚丙烯酰胺垂直板電泳技術[10]進行同工酶電泳，先對2個群體團頭魴不同組織的乳酸脫氫酶(LDH)和酯酶(EST)進行電泳，比較不同群體間同工酶酶譜的差異，然后選擇酶帶清晰的眼睛組織和血清進行下一步實驗，分析2個群體團頭魴內部個體間的差異。分離膠濃度7%，濃縮膠濃度4%，采用Tris-檸檬酸凝膠緩沖系統，200 V電泳2～3 h。LDH采用NAD染色法[11]， EST采用乙酸萘酯染色法[12]。

2 結果與分析

2.1 伊河團頭魴的形態(tài)特征

伊河團頭魴體高而側扁，呈菱形。頭小，吻鈍圓，口端位，口裂較寬，上下頜角度小。頭后背部顯著隆起。無須。眼中等大，位于頭部的前側部。上、下頜角質薄而窄，上頜角質呈三角形。上眶骨略呈三角形。背鰭不分枝鰭條為硬刺，最后一枚不分枝鰭條粗壯，其長度一般短于頭長。胸鰭較短，不至或僅達腹鰭基部。腹部自腹鰭至肛門間有皮質棱。尾柄短，尾柄高大于尾柄長。體呈青灰色，體側鱗片基部淺色，兩側灰黑色，在體側形成數行淺色縱紋。實驗所用伊河團頭魴的基本性狀比例值見表1。

表1 伊河團頭魴實驗組可量性狀測定結果Tab.1 Determination of measurable traits for Megalobrama amblycephala samples from Yi River n=30

2.2 乳酸脫氫酶同工酶在2個群體團頭魴不同組織中的表達

乳酸脫氫酶同工酶在2個群體團頭魴的眼睛、肌肉、心臟、腎臟和血清等組織中共檢測出6條酶帶(圖1)。伊河團頭魴群體在腎臟組織中檢測出6條帶，眼睛和心臟組織中檢測出5條帶，肌肉組織和血清中檢測出4條帶。梁子湖團頭魴群體在腎臟組織中檢測出6條帶，眼睛、肌肉和心臟組織中檢測出5條帶，血清中檢測出4條帶。2個群體乳酸脫氫酶同工酶表達相同的地方：在眼睛組織中都檢測出5條帶，并且5條帶的亮度基本相同，酶活性相同；在心臟組織中檢測出5條帶，其中LDH2和LDH3活性高，條帶較亮；在腎臟組織中均檢測出6條帶，其中LDH1為其他組織中未檢測到的，LDH2和LDH6條帶亮，酶活性較高；血清中檢測出4條帶，LDH5和LDH6條帶亮，活性高，但血清的酶活性整體低于其他幾個組織中酶的活性。2個群體同工酶表達不同的地方：在肌肉組織中梁子湖群體檢測出5條酶帶，伊河群體檢測出4條帶，伊河群體缺少LDH2條帶。LDH同工酶在眼睛組織中5條酶帶清晰可辨，各條帶亮度差異不大，因此選擇眼睛組織做進一步的分析。

2.3 酯酶同工酶在2個群體團頭魴不同組織中的表達

酯酶同工酶在2個群體團頭魴的眼睛、肌肉、心臟、腎臟和血清等組織中共檢測出4條酶帶(圖2)。伊河團頭魴群體在眼睛、肌肉、心臟和腎臟組織中檢測中2條帶，分別為EST1和EST4，其中腎臟組織中EST1和EST4條帶亮度較高，酶的活性較高，而其他三個組織中EST同工酶活性較弱；血清中也檢測出2條酶帶，其中EST2沒有出現在其他組織中，EST1條帶亮度高，酶活性強。梁子湖團頭魴群體在眼睛、肌肉、心臟和腎臟組織中檢測出2條帶，分別為EST1和EST4，其中腎臟組織中EST1和EST4條帶亮度較高，酶的活性較高，而其他3個組織中EST同工酶活性較弱；血清中也檢測出2條酶帶，其獨有的EST3沒有出現在其他組織中，EST1條帶亮度高，酶活性強。2個群體EST同工酶表達相同的地方：在眼睛、肌肉、心臟、腎臟和血清等組織中的均檢測出2條酶帶。血清中的EST1條帶亮度最高。2個群體同工酶表達不同的地方：伊河群體在血清中檢測出的為EST2，而梁子湖群體檢測出的為EST3，是兩個不同的酶帶。2個群體EST同工酶在血清中表達有差異，用血清進行下一步的同工酶分析。

2.4 乳酸脫氫酶同工酶在2個群體團頭魴不同個體中的表達

LDH同工酶在伊河群體不同個體眼睛組織中的酶譜條帶清晰，個體間差異不大，5號個體LDH6活性略低于其他個體(圖3A)；LDH同工酶在伊河群體不同個體血清中酶活性低(圖3B)，大部分個體LDH3、LDH4條帶不清晰。梁子湖群體不同個體眼睛組織中LDH酶譜條帶清晰，8號個體LDH5活性低于其他個體(圖4A)；梁子湖群體不同個體血清中LDH同工酶個體間存在差異(圖4B)，1號個體和3號個體檢測出5條酶帶，其他個體為4條帶。2個群體LDH同工酶在眼睛組織中均呈現5條清晰的譜帶，而在血清中酶帶不清晰，梁子湖群體LDH在血清中的表達存在個體差異。

2.5 酯酶同工酶在2個群體團頭魴不同個體中的表達

伊河群體不同個體眼睛組織中均可見EST1和EST4兩條帶，清晰可辨(圖5A)。伊河團頭魴不同個體血清中酯酶同工酶檢測出3條帶(圖5B)，EST1酶活性明顯高于EST2和EST3，個體間的差異主要體現在EST2和EST3上。梁子湖團頭魴不同個體眼睛組織中酯酶同工酶檢測出2條帶，EST1條帶較亮，酶活性高于伊河團頭魴群體的EST1(圖6A)。梁子湖團頭魴不同個體血清中酯酶同工酶的酶譜中有EST1和EST2兩條帶，EST1酶活性明顯高于EST2，個體間差異不大(圖6B)。2個群體EST同工酶在眼睛組織中表達穩(wěn)定，均為兩條帶，在血清中酶帶條數存在差異，EST2僅出現在伊河群體中，梁子湖群體中未檢出。

3 討論

3.1 同工酶表達的組織特異性

同工酶是基因表達的產物，其表達受到諸多內外因素的影響，基因在各組織間的表達時間和強度上的不一致造成了不同組織同工酶酶譜的特異性[13]。LDH同工酶是糖代謝中是非常重要的一類氧化-還原酶類，LDH-A基因表達的酶類多在厭氧組織骨骼肌中優(yōu)勢表達，其功能是將丙酮酸還原為乳酸；LDH-B基因表達的同工酶多在含氧組織中優(yōu)勢表達，其功能是將乳酸氧化為丙酮酸[14]。本研究中肌肉組織中的LDH5活性明顯高于其他組織，與葉星等[15]在團頭魴中和張濤等[16]在美洲鰣(Alosasapidissima)中的結果一致。LDH5為LDH-A基因表達，其主要作用是催化丙酮酸轉化為乳酸，在肌肉這類厭氧性器官中含量較高，肌肉組織的主要功能是運動，與肌肉組織反應活躍的生理功能相一致。心臟組織中LDH1的活性明顯高于其他組織，LDH1主要催化乳酸氧化成丙酮酸進入三羧酸循環(huán)，在心臟等好氧器官中含量多活性強，與心臟組織中糖的有氧代謝活躍相一致[17]。

酯酶同工酶能催化酯鍵水解，屬于水解酶類，在酯代謝和生物膜的結構等方面發(fā)揮作用，硬骨魚類中酯酶有單體和二聚體的類型[18]，其是由染色體上不同的基因或共顯性的等位基因譯制的，是直接的基因產物，所以在種屬的鑒定和遺傳研究方面作用重大[19]。本研究中眼睛組織和肌肉組織中都只檢測出EST同工酶的2條酶帶，與葉星等[15]和吳興兵等[20]對團頭魴EST同工酶的研究結果一致。肌肉組織中檢測出2條帶，與余來寧等[21]、歐陽敏等[22]在團頭魴肌肉組織中檢測出4條帶的結果不同，可能是由于不同地域的團頭魴群體所導致的差異。血清中EST1的活性最強，明顯大于EST2和EST3，這與歐陽敏等[22]對團頭魴EST酶的研究結果相同。酯酶具有解毒作用，泥鰍血清中酯酶的表達與其他組織有較大差異[23]，本研究血清EST同工酶在梁子湖群體中檢測出3條帶，在伊河群體中檢測出4條帶，群體間的差異主要表現在血清中，可能與2個群體不同的生態(tài)環(huán)境有關。

3.2 同工酶表達的個體差異

同工酶在同一物種不同個體中的表達也存在差異，張濤等[24]對達氏鱘(Acipenserdabryanus)的研究中發(fā)現眼睛晶狀體和肌肉組織中出現LDH酶帶差異，在肝臟組織中酶活性存在個體差異。本研究中LDH同工酶在活性和譜帶上出現個體差異，如伊河群體5號個體和梁子湖群體8號個體眼睛組織LDH活性與其他個體有差異，梁子湖群體血清的LDH酶帶與其他個體不同，可能與其個體所處的發(fā)育狀態(tài)和健康狀況有關。

酯酶同工酶具有明顯的多態(tài)性，在不良環(huán)境的影響下會產生變異，酯酶的表達會有顯著的變化[25-26]，本研究中伊河群體團頭魴有一條獨有的EST2酶帶，并且出現頻率較高，可能和其獨特的生存環(huán)境有關，需要做進一步的研究。

3.3 伊河團頭魴的生化遺傳標記

LDH同工酶在肌肉組織和腎臟組織中有明顯的拖尾現象，可能是采樣過程中造成的污染，如實驗魚前期放血不徹底，導致肌肉取樣時混入血液，對肌肉組織造成污染，以后取樣過程中應該嚴格取樣流程，盡量避免對樣品造成污染；而腎臟組織成分本身比較復雜，取樣時如果和其他組織分離不徹底，可能會造成污染，腎臟組織不適合作為生化遺傳標記使用。國家標準《團頭魴》[27]中采用血清LDH作為生化遺傳標記，而本研究中在伊河團頭魴血清LDH同工酶檢測出多態(tài)性，條帶清晰度不高，不適合作為生化遺傳標記使用。心臟組織中的LDH同工酶條帶分離效果較好，但是條帶的清晰程度不如眼睛組織中的LDH同工酶。伊河群體LDH同工酶在眼睛組織中酶帶清晰，表達更為穩(wěn)定，個體間沒有差異，初步確定用眼睛組織中的LDH同工酶作為鑒定伊河團頭魴的備選生化遺傳指標。隨機選擇另外30尾樣本魚進行LDH同工酶分析，結果發(fā)現所有個體均呈單態(tài)，且酶帶清晰，分離效果好，因此選取眼睛組織中的LDH同工酶作為鑒定伊河團頭魴種質的生化遺傳標記。

4 結論

本研究通過聚丙烯凝膠電泳對兩個群體團頭魴5種組織2種同工酶進行分析，發(fā)現LDH和EST同工酶在不同組織中均表現出特異性，個體間也存在差異，初步確定了眼睛組織中的LDH同工酶可作為鑒定伊河團頭魴種質的生化遺傳標記。對伊河魴同工酶的研究有利于對該群體開展種質鑒定和保護，研究結果可為團頭魴的育種工作提供參考依據。