鄒曜宇，徐彥，谷瑞環(huán)，李志超，伏靜，孫貽娟

(復旦大學附屬婦產科醫(yī)院上海集愛遺傳與不育診療中心，上海 200011)

胚胎染色體異常是導致胚胎著床失敗和反復流產的主要因素，給人類輔助生殖技術(ART)帶來了嚴重障礙。近年來胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)技術的應用有效避免了染色體異常導致的妊娠失敗或新生兒缺陷，顯著提高了移植成功率和活產率[1]。但是，PGT的操作存在一定局限性：(1)費用不菲，等待時間長，且必須先行胚胎冷凍；(2)操作復雜，操作的侵入性和復雜性可能導致錯誤的結果[2]；(3)為有創(chuàng)性檢測，目前缺乏對新生兒乃至子代健康狀況的長期隨訪，故可能存在一定的安全隱患。因此，建立快速、無創(chuàng)、安全、可靠的方法預測胚胎整倍性，將對輔助生殖工作帶來巨大的幫助。

時差成像技術(Time-lapse)是近年來發(fā)展的一項無創(chuàng)胚胎培養(yǎng)技術，可獲取胚胎發(fā)育各階段的形態(tài)，記錄特定事件發(fā)生時間，被越來越多地應用于研究胚胎發(fā)育潛能和整倍性預測。但是，利用該技術獲得的胚胎形態(tài)動力學參數是否與染色體整倍性之間存在聯系尚無統(tǒng)一結論，有效參數如何選擇也一直存在很大爭議[3-7]。為了解決這一問題，本研究比較了形態(tài)動力學參數在整倍體和非整倍體胚胎之間的差異，旨在為更好地實施選擇性單胚胎移植奠定可靠的理論基礎。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2016年6月至2019年12月間在復旦大學附屬婦產科醫(yī)院上海集愛遺傳與不育診療中心接受第三代試管嬰兒治療的150例患者的臨床資料。女方年齡23～49歲。納入標準：患者不孕年限≥1年；滿足PGT指征，包括夫妻雙方或一方為遺傳病患者或攜帶者/反復種植失敗/不明原因反復流產/高齡(年齡≥38歲)。

納入患者共獲得561枚評分在4BC/4CB及以上的可用囊胚。由于無法對逆分裂胚胎進行形態(tài)動力學參數標記，故去除了逆分裂胚胎共11枚，最終550枚胚胎納入統(tǒng)計分析。根據囊胚整倍性分為整倍體胚胎組(250枚)和非整倍體胚胎組(300枚)，并對兩組胚胎進行比較。

二、方法

1.控制性促排卵：采用常規(guī)拮抗劑或短期GnRH激動劑促排方案，當B超監(jiān)測下至少有1個優(yōu)勢卵泡平均直徑達18 mm以上時，于當晚注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠)，36 h后在超聲引導下經陰道行卵泡穿刺，獲得卵母細胞復合物。

2.胚胎體外培養(yǎng)：卵母細胞采集后剝除顆粒細胞，選出MⅡ卵，2～4 h后行ICSI注射。胚胎立刻放置于Time-lapse培養(yǎng)箱EmbryoScope(Vitrolife，瑞典)的培養(yǎng)皿Embryoslide(Vitrolife，瑞典)中，培養(yǎng)環(huán)境6%CO2、5%O2、37℃，在G-1培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)至受精后66～68 h(D3)，短暫取出換成G-2培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)并透明帶激光打孔，繼續(xù)培養(yǎng)至授精后113～139 h(D5～D6)。Time-lapse機器拍攝間隔頻率為15 min，有效監(jiān)測胚胎發(fā)育全過程。選擇D5或D6發(fā)育至囊胚、Gardner評分[8]在5BC/5CB及以上的可用囊胚且未發(fā)生逆分裂的胚胎共550枚納入分析。

3.單核苷酸多態(tài)性(SNP)芯片檢測：在D5或D6選擇5BC/5CB及以上的可用囊胚進行滋養(yǎng)層細胞活檢，將活檢胚胎置于顯微操作皿中，用顯微固定針固定胚胎，活檢針輕輕吸取孵出的滋養(yǎng)層細胞，利用激光破膜儀(Hamilton Thorne，美國)切割4～5個細胞。通過REPLI-g Single Cell Kit 試劑盒(Qiagen，德國)對獲取的胚胎滋養(yǎng)層細胞進行全基因組擴增。擴增產物應用Human Cyto-12 microarray芯片(Illumina，美國)進行第二輪擴增、DNA片段化、沉淀、重懸、芯片雜交、洗滌、SNP單堿基延伸、著色等。芯片結果通過iScan reader儀(Illumina，美國)掃描，并利用Bluefuse-Multi軟件(Illumina，美國)進行胚胎染色體拷貝數變異分析。

4.胚胎評估：利用EmbryoViewer軟件(UnisenseFertilitech，丹麥)記錄胚胎發(fā)育過程中的時間參數。14個胚胎早期形態(tài)動力學參數：以授精時間為起點，第二極體排出時間標記為tPB2，原核出現和消失時間分別為tPNa和tPNf，發(fā)育至2細胞至8細胞的時間分別為t2、t3、t4、t5、t6、t7、t8，第二、三個細胞周期間隔時間為cc2(t3-t2)和cc3(t5-t3)，標志第二、三次細胞分裂同步性指標分別為s2(t4-t3)和s3(t8-t5)；5個晚期形態(tài)動力學參數：開始致密化的時間為tC，形成桑椹胚時間為tM，形成囊胚時間為tSB，囊胚孵出時間為tHB。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、患者一般情況及胚胎一般資料

納入患者的平均年齡為(32.20±4.61)歲，平均體重指數(BMI)為(21.73±2.92) kg/m2。PGT指征中，94例(62.67%)為遺傳病患者或攜帶者，11例(7.33%)為反復種植失敗患者，42例(28.00%)為反復流產患者，3例(2.00%)為高齡患者。68例患者(45.33%)采用短方案促排卵，82例患者(54.67%)采用拮抗劑方案促排卵?；颊叩幕AFSH、E2、LH、P、抗苗勒管激素(AMH)水平分別為(7.40±1.78)U/L、(169.31±71.30)pmol/L、(5.49±4.36)U/L、(2.12±3.04)nmol/L和(5.00±3.29)ng/ml。平均獲卵數、D3有效胚胎數和可用囊胚數分別為(14.24±6.04)枚、(8.85±4.18)枚和(3.53±2.25)枚。

二、早期形態(tài)動力學參數比較

對授精至卵裂前的形態(tài)動力學指標進行比較，整倍體胚胎和非整倍體胚胎的tPB2、tPNa與tPNf比較無顯著性差異(P>0.05)。對卵裂期的形態(tài)動力學指標進行比較，整倍體胚胎的t4和s2均顯著小于非整倍體胚胎(P<0.05)，t2、t3、t5、t6、t7、t8、cc2、cc3和s3兩組間比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 整倍體和非整倍體胚胎的早期形態(tài)動力學參數比較[h，M(P25，P75)]

三、晚期形態(tài)動力學參數比較

對胚胎致密化后的晚期形態(tài)動力學參數進行比較，整倍體胚胎的tHB顯著小于非整倍體胚胎(P<0.05)，tC、tM、tSB、以及囊胚孵出與囊胚形成的間隔時間(tHB-tSB)的兩組間比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 整倍體和非整倍體胚胎致密化后形態(tài)動力學參數比較[h，M(P25，P75)，(-±s)]

討 論

選擇最具發(fā)育潛力的胚胎，獲得單胎、足月的健康子代是輔助生殖工作的宗旨。然而年輕女性體外授精后D3胚胎的非整倍體概率約為65%，D5囊胚的非整倍體概率約為45%，且這一比例在35歲以上女性中更高[9]，即使在自然人群中染色體異常概率也有約0.5%[10]。因此，如何在大量胚胎中剔除非整倍體胚胎、挑選出最具發(fā)育潛能的胚胎和整倍體胚胎，以得到良好的臨床結局是生殖技術的目標[11]。目前已有一些研究希望借助無創(chuàng)的囊胚液或培養(yǎng)液中胚外DNA檢測對胚胎整倍性進行預測[12]，但這些方法經濟成本較高，耗時長，且準確性有待提高。

近年來Time-lapse技術在輔助生殖領域大量應用，研究者發(fā)現胚胎的形態(tài)動力學蘊含了大量關于胚胎發(fā)育潛能的信息[13-14]，借助Time-lapse系統(tǒng)進行整倍性預測，不僅具有無創(chuàng)、快速、安全性高的特點，而且成本低，具有較為突出的優(yōu)點。然而關于各項技術指標的有效性仍未達成共識，已有多篇文章認為卵裂期和(或)囊胚期的形態(tài)動力學參數可以預測胚胎整倍性，但是有效指標不盡相同，預測方法也不一樣[3，6，15-16]；也有學者認為Time-lapse并不能幫助預測胚胎整倍性[5，7，17-18]。這些差異可能是由不孕原因、促排方案、染色體異常情況、胚胎培養(yǎng)液和培養(yǎng)氣體環(huán)境等因素不同導致[19]，也可能與研究方法不同有關，例如有些研究對年齡等混雜因素進行了校正[4，7，20]，而有些則沒有校正[16-17]。

在本研究中，由于逆分裂胚胎無法標記其細胞分裂時間點，且多項研究表明逆分裂胚胎的移植成功率為0%[21-22]，因此本研究均以未發(fā)生逆分裂的胚胎作為研究對象。本研究結果顯示整倍體和非整倍體胚胎的t4和s2存在顯著性差異，表明非整倍體胚胎發(fā)育至四細胞的時間延長、第二次細胞周期同步性較差。我們發(fā)現s2在整倍體和非整倍體胚胎間的中位數相差很小(0.01 h)，但第三分位數相差較大(0.25 h)，提示非整倍體胚胎的s2分布向后偏移，即有較多非整倍體胚胎的三、四細胞發(fā)育間隔較長。胚胎發(fā)育是一個有序且復雜的過程，多個階段都可能發(fā)生染色體異常，包括受精前的卵源性染色體非整倍性及染色體變異拷貝數異常，體外授精過程中因環(huán)境變化和體外操作導致的染色體重組、排列和分離異常，以及后續(xù)每一次細胞分裂都可能存在的染色體復制和分離異常。染色體狀態(tài)是胚胎的內在因素，合適的細胞分裂時間與染色體狀態(tài)保持著一定聯系，例如，一旦姐妹染色單體錯誤附著在紡錘體微管上，M期細胞周期檢驗點將被激活，繼而啟動修復過程，但這一過程延長了細胞周期，使得細胞分裂變慢，因此分裂過慢可能提示發(fā)生了DNA損傷或染色體畸變[23]。如果細胞周期檢查點也發(fā)生了錯誤，將導致非整倍體的出現。這可能可以解釋非整倍體胚胎的t4、s2比整倍體胚胎延長的原因。在臨床工作中，優(yōu)先選擇t4數值小的胚胎、同時降低s2較大胚胎的移植順序，可能會提高整倍體胚胎的選擇概率，提高胚胎種植率、降低流產率，后續(xù)工作中需要對此進行深入研究。

本研究結果還發(fā)現，致密化后兩組胚胎間tC和tM比較沒有顯著性差異，非整倍體胚胎的tSB具有增大的趨勢，但尚無顯著性差異(P=0.095)，直至tHB兩組間出現了顯著性差異，提示非整倍體胚胎在致密化后逐漸發(fā)育減慢。囊胚的孵出時間直接影響與移植窗口期的對接，因此具有重要的臨床意義。由于我們在胚胎發(fā)育D3進行了人工輔助孵化，因此該數據并不能完全反映自然情況下的囊胚孵出時間。但是，tHB更短的胚胎可能具有更強的活力，優(yōu)先選擇tHB短的胚胎進行移植可能會提高整倍體胚胎的選擇概率，提高胚胎種植率。

Minasi等[4]通過對928枚囊胚進行滋養(yǎng)層細胞活檢，比較基因組雜交芯片染色體檢測和胚胎形態(tài)動力學參數，發(fā)現整倍體胚胎的t4、 s2和tHB顯著短于非整倍體。我們的研究結果與之相似。但由于不同中心得出的有效指標不盡相同，多中心大樣本研究可能具有更加廣泛的意義。通過Time-lapse平臺獲取的胚胎形態(tài)動力學參數不僅在區(qū)分整倍體和非整倍體胚胎中具有一定作用，還可預測D3胚胎發(fā)育成囊胚的潛能[13-14]、預測移植胚胎的臨床結局[24]，并且與傳統(tǒng)胚胎選擇方法相比，利用 Time-lapse技術選擇早期胚胎，可以在顯著減少移植胚胎數的基礎上，維持穩(wěn)定的臨床妊娠結局[25]，因此Time-lapse具有巨大的臨床應用前景。這些研究均發(fā)現第2次細胞周期分裂同步性較好的胚胎即s2短的胚胎具有更強的發(fā)育潛能，提示形態(tài)動力學參數s2是胚胎選擇的重要參考指標[13-14，24]。

綜上所述，本研究結果表明，采用常規(guī)促排方案、對滿足PGT指征患者的胚胎在EmbryoScope機器中行G1G2序貫培養(yǎng)，于D3行激光輔助孵化后，發(fā)育至有效囊胚的早期形態(tài)動力學參數t4、s2和晚期形態(tài)動力學參數tHB可能成為預測胚胎整倍性的有效指標。由于在輔助生殖工作中難以對染色體狀態(tài)等影響胚胎發(fā)育潛能的關鍵因素進行及時的判斷，利用Time-lapse技術進行胚胎選擇可能具有重要的參考意義。