李亮亮 由玉巖 金修哲 張 卓 孫樂天衛(wèi)澤珍 楊引亮 劉學(xué)鋒 張成林 李曉光

(1.太原動物園，太原，030009；2.圈養(yǎng)野生動物技術(shù)北京市重點實驗室，北京，100044)

華北豹(Pantherapardusfontanierii)又稱金錢豹、中國豹，屬于哺乳綱(Mammalia)，食肉目(Carnivora)，貓科(Felidae)，豹屬，大型食肉動物，是我國特有的一個亞種，被列為國家Ⅰ級重點保護(hù)動物。

動物體內(nèi)雌激素(主要是雌二醇)變化對動物發(fā)情周期有很重要的調(diào)節(jié)作用，因此測定雌二醇水平對于該物種的繁殖和保護(hù)具有重要的意義。利用血液樣品來測定華北豹雌二醇的含量是一種不錯的方法，但是采血時需要對動物進(jìn)行麻醉保定，對動物應(yīng)激很大。因此采用非損傷取樣法(noninvasive sampling)，該方法具有采集樣品方便，樣品易于保存，同時在采樣時不會對動物產(chǎn)生不良的應(yīng)激，且糞便中雌二醇含量反映的是動物一段時間內(nèi)的平均水平，能更加準(zhǔn)確地反映動物的生理狀態(tài)和繁殖性能。目前有東北虎(Pantheratigrisaltaica)[1]、獰貓(Caracalcaracal)[2]、川金絲猴(Rhinopithecusroxellanae)[3-4]、滇金絲猴(Rhinopithecusbieti)[5]、麋鹿(Elaphurusdavidianus)[6]、東北梅花鹿(Cervusnipponhortulorum)[7]等動物糞樣中激素的提取報道。但是迄今尚無關(guān)于華北豹糞樣中雌激素提取方法相關(guān)的報道。為此，本文篩選了甲醇加熱法、乙醇加熱法和乙醇蒸餾水法3種進(jìn)項實驗方法，探討適用于華北豹糞樣中雌激素的理想提取方法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2019年3月中旬，在太原動物園華北豹館采集的成年雌性華北豹的糞便樣品作為研究對象。選取1只健康，有繁殖史雌性華北豹作為取樣對象。

1.2 糞便樣品的采集與保存

前一天把獸舍打掃干凈，第2天8：00—9：00采集華北豹的糞樣，裝入自封袋內(nèi)，做好標(biāo)記，存入-20 ℃冰箱，備用。

1.3 糞便樣品雌二醇的提取

將糞便從-20 ℃冰箱中取出，在室溫條件下進(jìn)行解凍，待糞樣解凍后剔除雜質(zhì)，充分研磨粉碎并混合均勻，備用。

采用以下3種抽提方法進(jìn)行激素的提取。

1.3.1 乙醇加熱法(Ethanol-heating method)

參照Wasser等[8]的方法并進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化。

(1)用電子秤稱取1 g糞便于離心管中，加入80%的乙醇10 mL。

(2)然后在70 ℃振蕩水浴15 min。冷卻至4 ℃，離心(4 000 r/min，15 min)，取上清液至試管中。

(3)殘渣加入5 mL 80%乙醇重新懸浮起，渦旋震蕩1 min，離心(3 000 r/min，15 min)。

(4)合并上清液，將含有乙醇的上清液60 ℃水浴空氣吹干。

(5)加1 mL，0.05 mol/L的PBS復(fù)溶，-20 ℃保存，備檢。

1.3.2 甲醇加熱法(Carbinol-heating method)

參照郎冬梅等[9]、李瓊[10]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。

(1)用電子秤稱取1 g糞便于離心管中，加入90%的甲醇10 mL。

(2)在渦旋震蕩儀上充分震蕩1 min，置于60 ℃的恒溫水浴鍋中溫浴20 min。

(3)之后在離心機(jī)中以4 000 r/pm離心10 min，取上清液于新的離心管中，置于-20 ℃下保存，備檢。

1.3.3 乙醇蒸餾水法(Ethanol-distilled-water method)

參照高云芳等[11]方法并進(jìn)行改進(jìn)。

(1)用電子秤稱取1 g糞便于離心管中，加入90%的甲醇10 mL。

(2)超聲波振蕩30 min，離心(3 000 r/min，10 min)取3 mL上清液。

(3)再加入2 mL乙醇，超聲波振蕩30 min，離心(3 000 r/min，10 min)。

(4)取3 mL上清液，合并兩次上清液置玻璃瓶中，37 ℃水浴蒸發(fā)干燥。

(5)然后向玻璃瓶中依次緩慢加入3 mL甲醇、1 mL蒸餾水、2 mL乙醚，靜置30 min，此時溶液分成上下兩層。

(6)從下層中取2 mL溶液，37 ℃水浴蒸發(fā)干燥后，加入0.05 mol/L的PBS緩沖液1 mL，37 ℃水浴振蕩30 min，置于-20 ℃下保存，備檢。

1.4 華北豹糞樣中雌二醇含量的測定

將上述3種方法抽提樣品，每份各取500 μL于10 mL 離心管內(nèi)，用PBS溶液進(jìn)行10倍稀釋確保其檢測結(jié)果處于相應(yīng)試劑盒的允許檢測范圍之內(nèi)，將稀釋后的樣品保存于-20 ℃冰箱，備用。激素的檢測工作委托北京北方生物研究所進(jìn)行完成。每份樣品平行測試6次。所用檢測試劑盒為碘[125I]雌二醇放射免疫分析藥盒試劑盒(批號：20190420)。相關(guān)試劑盒的詳細(xì)參數(shù)詳見說明書。

1.5 數(shù)據(jù)的分析

采用K-S檢驗，試驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，然后采用單因素重復(fù)測量方差分析(one-way repeat measure ANOVA)，對具有顯著差異的組合分別進(jìn)行配對t-檢驗(paired-sampletttest)方法，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

變異系數(shù)是衡量各組(項)觀測值變異程度的統(tǒng)計量，標(biāo)準(zhǔn)差與平均數(shù)的比值為變異系數(shù)，用C-V來表示，變異系數(shù)小則方法組合的穩(wěn)定性高。公式為：C-V=SD/Mean×100%。

所有統(tǒng)計檢驗通過SPSS 20完成，所有數(shù)據(jù)的特征用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對圈養(yǎng)華北豹糞便樣品中雌二醇提取含量的對比

甲醇加熱法測得的含量為(2 815.47±297.47)pg/mL，乙醇加熱法測得的含量為(7 660.25±1 546.11)pg/mL，乙醇蒸餾水法測得的含量為(1 937.83±231.71)pg/mL。其中利用乙醇加熱法提取的雌二醇含量為高。以抽提方法為組內(nèi)因子，對糞便中雌二醇含量檢測結(jié)果進(jìn)行單因素重復(fù)測量方差分析，結(jié)果表明，甲醇加熱法與乙醇蒸餾水法2種提取方法的測定結(jié)果間無明顯差異，甲醇加熱法和乙醇蒸餾水法與乙醇加熱法測定結(jié)果間差異顯著。實驗結(jié)果見表1。

2.2 不同提取方法對圈養(yǎng)華北豹糞便樣品中雌二醇提取含量的對比

變異系數(shù)的大小能夠表征檢測的穩(wěn)定性，變異系數(shù)大則方法組合的穩(wěn)定性差，變異系數(shù)小則方法組合的穩(wěn)定性高。對于本研究而言，甲醇加熱法(21.02%)和乙醇加熱法(20.18%)的變異系數(shù)接近，說明這兩2方法提取的雌二醇穩(wěn)定性接近，甲醇加熱法(21.02%)和乙醇加熱法(20.18%)的變異系數(shù)小于乙醇蒸餾水法(27.03%)，說明乙醇蒸餾水法提取雌二醇穩(wěn)定性不如另外2種方法。實驗結(jié)果見表2。

表1 不同方法提取糞樣中雌二醇含量測定結(jié)果(Mean±SD)

表2 不同抽提方法的變異系數(shù)

3 討論

本研究結(jié)果表明，不同的提取對華北豹糞便中雌二醇的提取效率有顯著差異。甲醇加熱法提取效率低；乙醇蒸餾法穩(wěn)定性明顯偏低且步驟煩瑣，不利于處理大批量的糞樣樣品。乙醇加熱法是經(jīng)典、高效率的雌二醇抽提方法，該方法已經(jīng)在多個動物的糞樣雌二醇的提取中，有理想的應(yīng)用效果[8，12-13]。

化學(xué)免疫分析法是最早用于激素檢測的免疫檢測法，20世紀(jì)50年代，就通過放射免疫技術(shù)在人的糞便中檢測到了雌二醇[14]。隨后，此項技術(shù)應(yīng)用于家畜牛中，該方法的靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定，若條件允許，可以選用化學(xué)免疫分析法進(jìn)行雌二醇水平檢測。

在本次實驗中，所采集的華北豹的糞便樣品均來自同一只動物，采集的動物樣本數(shù)量相對較少。為了保證實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠，在實驗中增加了樣本的重復(fù)數(shù)(6次)，以此減少誤差，達(dá)到確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠目的。

綜上所述，建議在提取華北豹糞便中雌二醇時，以乙醇加熱法提取糞便中雌二醇為較理想的一種提取方法。