李曉林 劉思旋 黃 潤 馬麗思 宗祥云

抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)為轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的一員，是一種二聚糖蛋白，也稱為苗勒管抑制物質(zhì)(Müllerian inhibiting substance，MIS)[1,2]。男性胎兒由發(fā)育中的睪丸產(chǎn)生AMH，可使苗勒管退化[3]。女性AMH主要由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生，其表達(dá)開始于初級卵泡，在次級卵泡和小腔卵泡中達(dá)到峰值。但AMH在原始卵泡和閉鎖卵泡中幾乎檢測不到，其水平在卵泡發(fā)育的最后階段逐漸下降[4,5]。因此，在臨床應(yīng)用中，血清AMH可作為評估卵巢儲備的一種標(biāo)志物。既往的詳細(xì)研究證實(shí)血清AMH水平可作為體外受精(IVF)和多囊卵巢綜合征(PCOS)中卵巢儲備和卵巢功能障礙的定量標(biāo)志物[6,7]。此外，AMH可能具有抑制原始卵泡向生長卵泡的招募和發(fā)育的作用[8]。

在年輕女性惡性腫瘤如淋巴瘤、婦科腫瘤、肺癌、乳腺癌患者中，其預(yù)后往往比老年患者差，病死率也較高[9，10]。包括具有生殖毒性藥物在內(nèi)的化療方案常用于治療年輕惡性腫瘤患者，而環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)是最常用的細(xì)胞周期非特異性細(xì)胞毒性藥物之一，常對卵巢功能造成不可逆的損害。目前對環(huán)磷酰胺破壞卵巢卵泡的機(jī)制尚不清楚，但最近的研究表明，環(huán)磷酰胺通過DNA烷基化和破壞正常細(xì)胞過程直接損傷卵泡，并通過損傷顆粒細(xì)胞消耗原始卵泡[11]。在AMH缺乏的情況下，更多的原始卵泡發(fā)育為生長卵泡，卵泡耗竭加快[12，13]。

目前，尋找一種可靠的生物學(xué)標(biāo)志物來預(yù)測化療后患者卵巢功能的損傷情況是十分必要的。雖然AMH已經(jīng)應(yīng)用于臨床卵巢功能的檢測，但由于血清AMH會受到很多因素的影響，所以一直存在爭議。研究表明，AMH作為卵巢儲備的生物學(xué)標(biāo)志物與女性自然生育能力無關(guān)[14]。Dezellus證實(shí)絕經(jīng)前乳腺癌患者化療后卵巢儲備發(fā)生快速改變，部分患者血清AMH水平會迅速恢復(fù)或保持平穩(wěn)[15]。盡管在人類研究中有這些結(jié)果，但在CTX給藥10天后測定血清AMH與青春期后小鼠生殖細(xì)胞破壞程度(原始卵泡)無相關(guān)性[12]。有關(guān)AMH是否可用于化療后卵巢功能的評估成為最近研究的熱點(diǎn)[16]。本研究檢測了血清AMH在小鼠不同年齡組的變化，以及不同劑量環(huán)磷酰胺對荷瘤小鼠血清AMH及各級卵泡的影響，從而明確血清AMH在評估化療后卵巢儲備功能損傷中的意義。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:(1)動物：4～6周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠及BALB/c裸鼠，由上海交通大學(xué)附屬上海市第六人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供[實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(滬)2017-0008]。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，室溫15～25℃，相對濕度45%～60%，每日正常光照，空氣流通，自由攝食、飲水。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理委員會批準(zhǔn)。(2)藥物與試劑：環(huán)磷酰胺(CTX)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，0.9%氯化鈉注射液購自安徽豐原藥業(yè)股份有限公司，戊巴比妥購自上海索萊寶生物科技有限公司，小鼠血清AMH-ELISA試劑盒購自上海優(yōu)培諾生物科技有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)隨機(jī)選取15只野生型雌性C57BL/6J小鼠，分別為1、4、6、8、12月齡(每月齡 3只)，麻醉后心臟采血留取血清、卵巢進(jìn)一步檢測。另外，隨機(jī)選取27只6周齡、體質(zhì)量15～20g的雌性近交系BALB/c裸鼠，每組小鼠皮下注射1×107個MCF7細(xì)胞，每2天觀察并記錄腫瘤生長情況。8周齡時(shí)，將27只裸鼠隨機(jī)分為3組(9只/組)，分別單次腹腔注射0.9%氯化鈉注射液、CTX100mg/kg、CTX200mg/kg。藥物處理前每組隨機(jī)抽取3只小鼠，麻醉后心臟采血，留取卵巢。然后在化療后1、3周，每組隨機(jī)抽取3只小鼠，麻醉后心臟采血，留取卵巢。卵巢用甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色(HE)。全血靜置1h后4℃過夜，離心后，吸取上清液。血清中 AMH 水平通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒測定。荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)流程如圖1。(2)血清ELISA檢測：空白孔不加樣，只加顯色劑和終止液用于調(diào)零。標(biāo)準(zhǔn)品孔加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50μl，然后加入酶標(biāo)試劑50μl。樣品孔加入血清50μl，然后加入酶標(biāo)試劑50μl。輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養(yǎng)箱中孵育60min。小心揭掉封板膜，洗滌液清洗5次，拍干。每孔加入顯色劑100μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10min。每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(A值)。(3)卵泡計(jì)數(shù)：HE染色切片厚度為5μm，每隔5張計(jì)數(shù)一張片子，上下同一個卵泡不重復(fù)計(jì)數(shù)，并應(yīng)用5倍校正因子來估計(jì)每個卵巢的卵泡總數(shù)。只記錄有卵母細(xì)胞核的卵泡。卵泡發(fā)育經(jīng)過5個階段，即原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、腔卵泡和黃體卵泡階段。原始卵泡卵母細(xì)胞周圍只有一層扁平顆粒細(xì)胞。若觀察到周圍是單層立方顆粒細(xì)胞，則為初級卵泡。次級卵泡有多層立方顆粒細(xì)胞。如果在顆粒細(xì)胞層中觀察到腔，則將卵泡歸類為腔卵泡。黃體可見異常卵母細(xì)胞和多層粘連顆粒細(xì)胞時(shí)。初級卵泡、次級卵泡和腔卵泡統(tǒng)稱生長卵泡。

圖1 荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)流程

結(jié) 果

1.正常小鼠各年齡組AMH水平及各組卵泡數(shù)目:為檢測不同年齡段C57BL/6J野生型雌性小鼠血清AMH水平及卵泡數(shù)量，分別留取了1、4、6、8、12月齡小鼠的血清及卵巢。可以看到血清AMH早期呈上升趨勢，隨著年齡的增長呈顯著下降趨勢(圖2)。根據(jù)小鼠AMH水平可將其生殖狀態(tài)分為3個階段。第1階段血清AMH水平在4月齡前明顯升高(P=0.000)。第2階段4～8月齡小鼠血清AMH水平相對穩(wěn)定(4月齡vs 6月齡，P=0.28；4月齡vs 8月齡，P=0.98)。第3階段8月齡以上小鼠血清AMH水平顯著下降(P=0.000)，表現(xiàn)為小鼠月經(jīng)周期不規(guī)則，進(jìn)入圍絕經(jīng)期。通過對卵泡計(jì)數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，原始卵泡數(shù)量呈下降趨勢，6～8月齡下降較為明顯(P=0.000，圖3 A)。6月齡前生長卵泡數(shù)量增加(r=0.91,P=0.000)， 6～8月齡保持穩(wěn)定(r=0.91, 6月齡 vs 8月齡，P=0.21)， 8月齡后顯著下降(r=0.91,P=0.000，圖3B)。組織學(xué)表現(xiàn)見圖4。小鼠血清AMH水平與生長卵泡數(shù)量之間存在顯著相關(guān)性(圖5)。

圖2 正常小鼠不同年齡段血清AMH水平與4月齡比較，*P=0.000

圖3 正常小鼠不同年齡段原始卵泡與生長卵泡的數(shù)量變化與1月齡比較，*P=0.000;與4月齡比較，#P=0.000

圖4 不同月齡段小鼠卵巢HE染色(×200)A.1月齡；B.4月齡；C.6月齡；D.8月齡；E.12月齡

2.化療后荷瘤小鼠AMH水平及卵泡數(shù)目變化:為觀察不同劑量環(huán)磷酰胺對小鼠卵巢的損傷情況，分別留取了對照組、CTX100mg/kg組、CTX200mg/kg組荷瘤小鼠化療后不同時(shí)期的血清、卵巢。對照組及不同劑量化療組裸鼠腫瘤生長情況見圖6。3組荷瘤小鼠化療前腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且CTX100mg/kg組腫瘤生長與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CTX200mg/kg組腫瘤生長情況較為緩慢。BALB/c荷瘤裸鼠8周齡(化療前)、9周齡(CTX或0.9%氯化鈉注射液后1周)、11周齡(CTX或0.9%氯化鈉注射液后3周)血清AMH、原始卵泡及生長卵泡計(jì)數(shù)的變化趨勢見圖7、圖8。對照組小鼠血清AMH水平在8～11周齡無明顯變化，且各實(shí)驗(yàn)組8周齡(化療前)小鼠血清AMH水平較為一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CTX200mg/kg組的AMH水平顯著下降(P=0.000)。而在CTX100mg/kg組中，AMH水平在9周時(shí)先略有上升，在11周時(shí)明顯下降。各組原始卵泡隨時(shí)間推移均呈下降趨勢(P=0.000)，且高劑量CTX組原始卵泡數(shù)量下降趨勢十分顯著。而各組生長卵泡的數(shù)量與血清AMH水平的變化均一致。由HE切片可以看到化療后第3周各組生長卵泡數(shù)量的情況，以及高劑量CTX下卵巢周圍組織的改變(圖9)。

圖5 小鼠血清AMH水平與生長卵泡數(shù)量的關(guān)系

圖6 各組荷瘤小鼠腫瘤生長情況

圖7 不同劑量CTX對荷瘤小鼠AMH的影響

圖8 不同劑量CTX處理對荷瘤小鼠卵泡數(shù)量影響

圖9 化療后第3周各組小鼠卵巢HE染色情況(×200)A.對照組；B.CTX100mg/kg組；C.CTX200mg/kg組

討 論

研究證實(shí)，隨著年齡的增長，生長卵泡中AMH的表達(dá)水平保持穩(wěn)定[16]。因此，血清AMH水平的下降直接反映了卵巢生長卵泡數(shù)量的減少。Scheffer等[17]也認(rèn)為生長卵泡的數(shù)量反映了女性和小鼠卵巢儲備。本研究觀察到生長卵泡的數(shù)量與原始卵泡以及血清AMH水平密切相關(guān)。在成熟小鼠中AMH水平和原始卵泡數(shù)量都隨著年齡的增長而呈持續(xù)下降趨勢。但是在8月齡以上的小鼠，血清AMH水平和生長卵泡數(shù)量均呈穩(wěn)定下降趨勢，此前生長卵泡保持穩(wěn)定或者增長趨勢。由此筆者認(rèn)為一旦原始卵泡池大小達(dá)到一定閾值水平，維持生長卵泡池的補(bǔ)償機(jī)制可能不再有效。更重要的是，在生殖階段的后期，原始卵泡池的耗竭逐漸減緩，而生長卵泡數(shù)量的也在逐漸減少。這意味著原始卵泡的使用率在生殖階段早期是相對較低的，而在生殖階段后期有著更高的使用率。

2013年，Detti等[18]報(bào)道AMH不能很好地評估成年小鼠在青春期前暴露于CTX時(shí)的卵巢功能。此外，血清AMH水平無法預(yù)測環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的急性卵巢卵泡破壞。本研究發(fā)現(xiàn)血清AMH水平在前6個月是不斷升高的，之后隨著年齡的增長而下降。在未成熟的雌性小鼠和女性中，AMH水平隨著卵泡的生長而升高。此后，小鼠生殖早期生長卵泡數(shù)量保持不變，同時(shí)AMH水平不變。這表明補(bǔ)償機(jī)制是存在的，以保持不斷增長的卵泡的數(shù)量。因此，盡管原始卵泡池下降，血清AMH水平是恒定的。也有可能，相對較多的原始卵泡從卵泡池中被招募，以維持?jǐn)?shù)量恒定的生長卵泡。因此，筆者的研究表明，血清AMH水平對于評估正常年輕小鼠卵巢儲備不夠準(zhǔn)確和合適。

低劑量CTX對小鼠AMH水平的影響并不顯著，原始卵泡略有減少，生長卵泡一過性增多，然后減少，卵巢儲備功能的損傷程度較小。不同的是，高劑量CTX小鼠AMH明顯下降，原始卵泡數(shù)量明顯減少，生長卵泡數(shù)量也有下降。因此，血清AMH水平對化療導(dǎo)致的有限的卵巢儲備更為敏感，或者說在卵巢儲備充裕的個體其卵泡池的消耗無法通過AMH體現(xiàn)、而在卵巢儲備有限的個體血清AMH的波動則能忠實(shí)地反映卵巢儲備的流失，可用于評估化療藥物對卵巢儲備功能的損傷。

本研究的意義在于以下幾個方面：(1)驗(yàn)證了小鼠血清AMH水平與原始卵泡及生長卵泡之間的關(guān)系，與生長卵泡的數(shù)量呈正比，當(dāng)卵巢儲備下降到一定界值后，隨著原始卵泡的數(shù)量減少而降低。(2)明確了不同年齡段雌性小鼠AMH的分布，在成熟及年老的小鼠中，AMH更能反映其卵泡儲備的情況。(3)化療毒性不良反應(yīng)下，AMH水平可以反映其卵巢儲備功能的損傷情況。