鐘名金 敖英芳

1 深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院（深圳市第二人民醫(yī)院）運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科（深圳518000）

2 北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所（北京100191）

膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）斷裂是臨床上常見(jiàn)且嚴(yán)重的傷病[1]。ACL斷裂后患膝關(guān)節(jié)失穩(wěn)，脛骨出現(xiàn)反常的前向移動(dòng)，使關(guān)節(jié)接觸面和應(yīng)力發(fā)生變化，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷[2，3]。一側(cè)膝關(guān)節(jié)ACL 斷裂后，在日?；顒?dòng)和運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，為保護(hù)患膝，健側(cè)膝關(guān)節(jié)將代償性地承受更多的負(fù)擔(dān)[4]。切斷狗一側(cè)后肢ACL 后，另一側(cè)后肢的負(fù)重較正常情況下增加12.8%～31.7%[5]。而持續(xù)的負(fù)載增加將會(huì)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生不利影響[6，7]。我們的前期臨床研究也發(fā)現(xiàn)，雙膝ACL斷裂的患者由于雙膝關(guān)節(jié)的生物力學(xué)和運(yùn)動(dòng)平衡機(jī)制打破，雙膝關(guān)節(jié)相互影響，造成對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)代償性負(fù)重增加，使得關(guān)節(jié)軟骨損傷的發(fā)生率和嚴(yán)重程度更高[8]。因此，本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察一側(cè)膝關(guān)節(jié)ACL 斷裂后在日?；顒?dòng)和運(yùn)動(dòng)條件下對(duì)健側(cè)（contralateral，CL）膝關(guān)節(jié)軟骨的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年新西蘭大白兔30 只，4～5月齡，體重2.5～3 kg，由專業(yè)飼養(yǎng)員分籠飼養(yǎng)，所有動(dòng)物均可充分獲得食物和飲用水。

1.2 動(dòng)物活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)方案[9]

采用兔運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練跑臺(tái)（北京智鼠多寶生物科技公司）模擬兔的日程活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)。跑臺(tái)主要由跑道、電機(jī)、操作臺(tái)、升降機(jī)等構(gòu)成。跑臺(tái)內(nèi)含3 個(gè)跑道，規(guī)格為（1560 mm×996 mm×280 mm），長(zhǎng)度適用于兔的奔跑，跑道速度由電動(dòng)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)，速度可無(wú)級(jí)調(diào)整，范圍為1～40米/分。兔運(yùn)動(dòng)開(kāi)始于術(shù)后第5天，每周5天，每天10分鐘，跑臺(tái)速度為0.3英里/小時(shí)（約8米/分鐘），其余時(shí)間在專業(yè)飼養(yǎng)籠（590 mm*420 mm*400 mm）里自由活動(dòng)。

1.3 手術(shù)方法[9]

ACL 切斷（ACL transection，ACLT）：采用耳緣靜脈注射20%烏拉坦（5 ml/kg）對(duì)動(dòng)物進(jìn)行全身麻醉，右膝關(guān)節(jié)為術(shù)側(cè)，將膝關(guān)節(jié)固定、備皮、消毒及鋪巾，經(jīng)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)髕旁切口，逐層分離至打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，將髕骨向外側(cè)脫位后屈膝下完全暴露ACL，用眼科剪在韌帶中段予以切斷并剪除2 mm 韌帶組織防止粘連愈合，行Lachman 試驗(yàn)確定韌帶完全切斷，生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，將髕骨復(fù)位，嚴(yán)密縫合關(guān)節(jié)腔及皮膚。假手術(shù)：動(dòng)物采用相同的切口在相同條件下切開(kāi)皮膚和打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，暴露ACL 但不予以切斷，生理鹽水沖洗后關(guān)閉傷口。為防止術(shù)后關(guān)節(jié)感染，術(shù)后予以每只動(dòng)物肌注40萬(wàn)單位的青霉素，連續(xù)3天。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

兔經(jīng)過(guò)1 周的適應(yīng)性籠養(yǎng)后，根據(jù)手術(shù)方式的不同隨機(jī)平均分為兩組：ACL 切斷組（ACLT/CL）和假手術(shù)組（Sham/CL），每組分別于術(shù)后12周、24周和36周處死兔子，獲取完整的左膝關(guān)節(jié)（CL），每次每組5 只兔子。

1.5 大體形態(tài)觀察

解剖膝關(guān)節(jié)，充分暴露股骨髁，觀察股骨內(nèi)髁軟骨的大體形態(tài)，采用如下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)[10]：0分：軟骨表面光滑，色澤光鮮。1分：局部軟骨面粗糙、纖維化或出現(xiàn)輕度的色澤發(fā)黃。2分：軟骨裂隙延伸至軟骨表層或中層。3 分：軟骨面裂隙至軟骨深層。4 分：軟骨剝離，軟骨下骨暴露。

1.6 組織學(xué)和二型膠原（COLⅡ）免疫組化染色

大體觀察后將兔膝關(guān)節(jié)固定于4%的中性多聚甲醛固定溶液中，固定72小時(shí)。標(biāo)本經(jīng)固定后自來(lái)水沖洗，用10%甲酸脫鈣液進(jìn)行脫鈣，每日更換脫鈣液至脫鈣充分，標(biāo)本用蒸餾水漂洗，至恢復(fù)中性pH。修整軟骨組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，以5 μm/層切片，行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin，HE）、甲苯胺藍(lán)染色（Toluidine Blue）。組織學(xué)評(píng)分采用國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究會(huì)（Osteoarthritis Research Society Interna?tional，OARSI）推出的關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)評(píng)分系統(tǒng)（OARSI 總分為24 分）[10]，此評(píng)分系統(tǒng)能準(zhǔn)確評(píng)估軟骨損傷情況。對(duì)軟骨組織切片采用“二步法”進(jìn)行COLⅡ免疫組化染色用于觀察軟骨基質(zhì)的COLⅡ含量變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算

大體觀評(píng)分和OARSI 評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)采用Mean±SD 表示，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀

ACLT/CL組：術(shù)后12周股骨內(nèi)髁軟骨表面完整，個(gè)別出現(xiàn)軟骨表面色澤發(fā)暗；術(shù)后24周軟骨表面出現(xiàn)局限性變薄，色澤鮮亮感消失，負(fù)重區(qū)軟骨出現(xiàn)壓痕、表面毛糙；術(shù)后36周軟骨損傷更加明顯。Sham/CL組：術(shù)后12 周、24 周和36 周，股骨內(nèi)髁軟骨均光滑，色澤紅潤(rùn)，未見(jiàn)明顯軟骨損傷（圖1）。大體觀評(píng)分結(jié)果顯示，術(shù)后24周、36周，ACLT/CL組和Sham/CL組在大體觀評(píng)分上均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖2）。

圖1 股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)軟骨大體觀

圖2 股骨內(nèi)髁軟骨大體觀評(píng)分

2.2 組織學(xué)染色

ACLT/CL 組：術(shù)后12 周，股骨內(nèi)髁軟骨染色均勻，個(gè)別軟骨表面淺表粗糙，但軟骨整體結(jié)構(gòu)完整。糖原含量豐富，COLⅡ表達(dá)豐富，呈深染狀態(tài)；術(shù)后24周，軟骨可見(jiàn)損傷，軟骨淺層裂隙，達(dá)軟骨的淺-中層，糖原染色減退、變淡，淺層軟骨COLⅡ出現(xiàn)淡染表現(xiàn)；術(shù)后36周，軟骨損傷結(jié)構(gòu)損傷達(dá)到中層，糖原丟失，軟骨表面COLII 失染。Sham/CL 組：術(shù)后12 周、24 周和36 周，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)層次清晰，糖原及COLⅡ含量豐富。

OARSI 評(píng)分結(jié)果顯示，術(shù)后24 周和36 周，ACLT/CL組和Sham/CL組在OARSI評(píng)分上均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖3 股骨內(nèi)髁軟骨組織學(xué)染色及COLⅡ免疫組化染色

圖4 股骨內(nèi)髁軟骨OARSI評(píng)分

3 討論

一側(cè)膝關(guān)節(jié)ACL斷裂后將對(duì)健側(cè)膝關(guān)節(jié)產(chǎn)生影響早已受到關(guān)注[10-15]。Fremerey 等[11]研究認(rèn)為，ACL 的急性損傷會(huì)導(dǎo)致患膝關(guān)節(jié)本體感覺(jué)的全面下降，而且對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)本體感覺(jué)的受損也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Edixhoven等[12]應(yīng)用Lachman 試驗(yàn)（－180～180 N）測(cè)試急性ACL斷裂、慢性ACL 斷裂患者和健康人群膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，ACL斷裂后不僅造成患膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，而且對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性也明顯下降。Shino等[13]使用200 N的力測(cè)試了91名單側(cè)ACL斷裂患者的對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)前向穩(wěn)定性，其中22例患者對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯前向松弛。這表明一側(cè)膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)將造成對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)。黃紅拾等[14]應(yīng)用步態(tài)分析儀測(cè)量ACL斷裂后雙下肢的步態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，ACL斷裂后，另一側(cè)下肢足底壓力在某些時(shí)相上與健康人具有明顯差異，提示對(duì)側(cè)下肢的步態(tài)改變，足-膝偶聯(lián)機(jī)制破壞。馬勇等[4]認(rèn)為，一側(cè)膝關(guān)節(jié)ACL斷裂后，患者在從事某些特殊動(dòng)作如急轉(zhuǎn)、落地等動(dòng)作時(shí)，有意識(shí)地保護(hù)傷側(cè)膝關(guān)節(jié)，從而大大增加了健側(cè)膝關(guān)節(jié)ACL損傷的風(fēng)險(xiǎn)。Ohno等[15]發(fā)現(xiàn)，ACL 斷裂將造成對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)周圍肌肉萎縮和收縮性能下降。因此，一側(cè)膝關(guān)節(jié)ACL 斷裂將對(duì)健側(cè)膝關(guān)節(jié)產(chǎn)生整體、全面的影響。

研究表明，關(guān)節(jié)軟骨對(duì)應(yīng)力變化異常敏感。膝關(guān)節(jié)生物力學(xué)機(jī)制改變、應(yīng)力增加、周圍肌肉萎縮導(dǎo)致的肌肉力量下降等異常因素均可引起關(guān)節(jié)軟骨損傷，最終導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）[16，17]。Zhou等[18]把兔一側(cè)膝關(guān)節(jié)用石膏固定而對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)不固定，造成兔僅使用一側(cè)膝關(guān)節(jié)負(fù)重活動(dòng)，2 周后石膏固定側(cè)膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)軟骨磨損，而負(fù)重側(cè)膝關(guān)節(jié)在4 周后也出現(xiàn)軟骨退變現(xiàn)象。Thomas 等[7]切斷小鼠一側(cè)膝ACL 和切除部分內(nèi)側(cè)半月板并讓其在旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)盤（rotat?ing cylinder）上運(yùn)動(dòng)，術(shù)后20周取對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行特殊免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞內(nèi)金屬基質(zhì)蛋白酶-13（MMP-13）和十型膠原（COLⅩ）表達(dá)明顯增加，而MMP-13 和COLⅩ是關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退變的標(biāo)志物。Chen 等[19]使用3-D MRI 技術(shù)對(duì)單側(cè)膝關(guān)節(jié)ACL 斷裂的患者進(jìn)行雙膝關(guān)節(jié)軟骨接觸面積掃描，并與健康未受傷的人群進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，ACL 斷裂不但造成傷側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)間室關(guān)節(jié)軟骨接觸面積改變，也會(huì)改變對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的接觸面積。Makela 等[20]通過(guò)手術(shù)方法切斷兔ACL斷裂造成早期OA，并取對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)外髁軟骨的動(dòng)態(tài)彈性模量只有正常軟骨的30%，引起這種改變的原因是表淺軟骨組織的組成成分出現(xiàn)微小變化，造成軟骨組織生物力學(xué)特性的下降，是一種非常早期退變的表現(xiàn)。但他們的實(shí)驗(yàn)僅觀察了術(shù)后4周，時(shí)間較短，且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也僅限籠養(yǎng)，無(wú)法模擬動(dòng)物膝關(guān)節(jié)的日常活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)，因此，他們只檢測(cè)到軟骨組織力學(xué)特性的早期變化，而并未發(fā)現(xiàn)軟骨結(jié)構(gòu)性的損傷。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)模擬了ACL 斷裂后的日常活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)條件，通過(guò)切斷兔一側(cè)膝關(guān)節(jié)ACL 制作ACL 斷裂模型，在較長(zhǎng)時(shí)間的活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)條件下，觀察到健側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨在術(shù)后24周出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨損傷，大體觀上表現(xiàn)為軟骨淺層磨損、淺表裂隙，術(shù)后36 周時(shí)關(guān)節(jié)軟骨損傷更加明顯，表現(xiàn)為軟骨部分缺損，裂隙深度達(dá)軟骨中層，軟骨糖原和COLⅡ丟失，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)集簇增生。相比之前的研究，本實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間較長(zhǎng)，并證實(shí)一側(cè)膝關(guān)節(jié)ACL 斷裂后較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)將造成健側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷。ACL斷裂造成健側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的最主要原因是患側(cè)膝關(guān)節(jié)長(zhǎng)期處于失穩(wěn)狀態(tài)，在活動(dòng)過(guò)程中健側(cè)膝關(guān)節(jié)將代償性地增加負(fù)重，長(zhǎng)此以往，關(guān)節(jié)軟骨在異常過(guò)載下出現(xiàn)軟骨損傷。結(jié)合我們的前期臨床觀察，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了一側(cè)膝關(guān)節(jié)ACL斷裂后在較長(zhǎng)期日?；顒?dòng)和運(yùn)動(dòng)條件下將對(duì)健側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生不利影響，造成軟骨損傷。這需要后期開(kāi)展更加完善的生物力學(xué)研究進(jìn)行印證。

本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于：（1）本實(shí)驗(yàn)以大體觀和組織學(xué)染色評(píng)估關(guān)節(jié)軟骨損傷可能導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)軟骨損傷的時(shí)間延遲；（2）兔膝關(guān)節(jié)雖然與人體膝關(guān)節(jié)類似，但兔膝關(guān)節(jié)長(zhǎng)期處于微屈狀態(tài)，軟骨負(fù)重區(qū)與人體存在一定差異；（3）本實(shí)驗(yàn)只對(duì)股骨內(nèi)髁軟骨進(jìn)行評(píng)估，未對(duì)其他組織如半月板、滑膜、關(guān)節(jié)液生化成分進(jìn)行檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究表明膝關(guān)節(jié)ACL斷裂后在較長(zhǎng)期日?；顒?dòng)和運(yùn)動(dòng)條件下將造成健側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷。臨床上應(yīng)重視膝關(guān)節(jié)ACL斷裂后由于膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)對(duì)健側(cè)膝關(guān)節(jié)整體的影響，尤其是關(guān)節(jié)軟骨損傷。