葸慧榮 高玉海 陳克明 馬慧萍

1. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院骨科研究所，甘肅 蘭州 730050； 2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050)

骨質(zhì)疏松是目前危害老年人身體健康的一種全身性骨骼疾病，其特點(diǎn)是骨量減少、骨密度降低、骨脆性增加，容易導(dǎo)致骨折[1]。因此，抗骨質(zhì)疏松藥物的研發(fā)已成為當(dāng)今社會的主要課題，特別是從天然中草藥中提取有效成分已成為抗骨質(zhì)疏松藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。淫羊藿苷為中藥淫羊藿的主要有效成分，是目前抗骨質(zhì)疏松癥常用的天然藥物有效成分之一[2]。淫羊藿苷屬于異黃酮類化合物，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，具有口服吸收差，生物利用度低等特點(diǎn)[3]。因此，我們對淫羊藿苷進(jìn)行劑型改造，制備成了新型納米混懸制劑，從而提高淫羊藿苷的水溶性和生物利用度。

本實(shí)驗(yàn)以自制的淫羊藿苷納米微粒處理成骨細(xì)胞。通過檢測成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶活性，鈣化結(jié)節(jié)染色面積和顏色以及相關(guān)成骨性蛋白的表達(dá)量變化，觀察淫羊藿苷納米微粒對成骨細(xì)胞礦化和成熟的影響，從而初步評價(jià)淫羊藿苷納米微粒的生物利用度是否得到有效提高。

1 材料和方法

1.1 材料

自制淫羊藿苷納米微粒；出生48 h以內(nèi)的Wistar大鼠乳鼠[甘肅省蘭州市聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科，動(dòng)物合格證號：SYXK(軍)2016-0029，動(dòng)物級別為SPF級]。淫羊藿苷(陜西省寶雞市辰光生物科技有限公司)；DMSO、胰蛋白酶(Sigma公司)；β-actin、Ⅰ型膠原(COLⅠ)、Runx-2、OSX、BMP-2、OPG、RANKL一抗均購自Abcam公司；胎牛血清(蘭州民海生物工程公司)；堿性磷酸酶試劑盒(南京建成)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Cell sig納米微粒Ling公司)；α-MEM培養(yǎng)基粉劑(美國Gibco公司)；Hochest 3342/PI(北京雷根生物技術(shù)有限公司)；BCA蛋白水平測定試劑盒[上海碧云天(Beyotime)生物技術(shù)有限公司]；ECL超敏化學(xué)發(fā)光液(武漢博士德公司)；淫羊藿苷納米微粒(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；正置熒光顯微鏡(Olympus，日本)；電泳儀、電轉(zhuǎn)移儀和酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國)；H1650-W臺式微量高速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，中國)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo 公司，美國)；超凈工作臺(北京半導(dǎo)體一廠，北京)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1淫羊藿苷納米微粒的制備方法

稱取處方量淫羊藿苷原料藥溶于1 mL二甲基亞砜溶液中作為油相；取適量的穩(wěn)定劑分散于20 mL蒸餾水中作為水相；使用超聲細(xì)胞破碎儀超聲并高速剪切水相，超聲過程中將油相緩慢勻速注入水相中，同時(shí)用冰水浴冷卻，即得淫羊藿苷納米微粒。

1.3.2大鼠顱骨原代成骨細(xì)胞的培養(yǎng)

取出生48 h內(nèi)的Wistar大鼠脫頸處死，經(jīng)酒精浸泡消毒處理后，于滅菌過的超凈工作臺中解剖乳鼠取出整個(gè)顱骨，剔除周圍軟骨組織，用PBS漂洗3～5次，將其全部搗碎裝于EP管中；加入適量胰酶消化細(xì)胞，8～10 min后棄去上清液并重復(fù)上述過程3次；再次漂洗后加入0.1%Ⅱ型膠原酶，于37 ℃恒溫水浴條件下消化細(xì)胞4次，每次15 min，棄去第一次收集的上清液，收集后3次消化液合并，加入適量的完全培養(yǎng)基終止消化；將收集的細(xì)胞懸液經(jīng)細(xì)胞篩過濾兩次，濾液以1 000 r/min離心5 min；棄去上清液，加入完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞團(tuán)塊，并連續(xù)吹打至分散均勻，接種于中號培養(yǎng)皿中于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。

1.3.3淫羊藿苷納米混懸液對成骨細(xì)胞形態(tài)的影響

培養(yǎng)成骨細(xì)胞，待細(xì)胞狀態(tài)良好且鋪滿皿底時(shí)，將細(xì)胞分為3組，分別為對照組(1×10-6mol/L DMSO)，淫羊藿苷組(1×10-6mol/L 淫羊藿苷溶液)、淫羊藿苷納米微粒組(1×10-6mol/L 淫羊藿苷納米微粒溶液)，加上述藥物處理細(xì)胞12、24 h后，觀察不同時(shí)間點(diǎn)藥物對細(xì)胞形態(tài)的影響。

1.3.4Hoechst 3342/PI 雙染色檢測細(xì)胞毒性

細(xì)胞樣品的制備：培養(yǎng)成骨細(xì)胞至鋪滿皿底，分別加藥處理24 h后棄培養(yǎng)基，PBS洗滌兩次，加入1 mL細(xì)胞染色緩沖液、5 μL Hoechst 染色液和5 μL PI 染色液冰浴或 4 ℃ 染色30 min。染色后經(jīng) PBS 洗滌一次，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

1.3.5堿性磷酸酶(ALP)活性測定

將培養(yǎng)的第一代細(xì)胞接種于三個(gè)中號培養(yǎng)皿中，每3 d更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿皿底且狀態(tài)良好時(shí)加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d和6 d后，分別用堿性磷酸酶檢測試劑盒(按說明書操作)檢測細(xì)胞內(nèi)ALP的水平。

1.3.6茜蘇紅鈣化結(jié)節(jié)染色

取P1代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞分別進(jìn)行加藥處理，同時(shí)加入適量的成骨性誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔3 d換一次培養(yǎng)基，第12 d后棄掉培養(yǎng)基，用PBS漂洗兩遍，加入2 mL 4%多聚甲醛固定10 min，棄去多聚甲醛再用PBS漂洗兩次。向培養(yǎng)皿中加入適量0.1%的茜素紅染色液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置30～45 min，待培養(yǎng)皿中逐漸出現(xiàn)深紅色斑點(diǎn)時(shí)，棄去茜蘇紅染液，去離子水漂洗2次，于顯微鏡下拍照取圖，觀察染色后鈣化結(jié)節(jié)區(qū)域的面積。

1.3.7成骨特異性蛋白表達(dá)量的檢測

棄掉加藥處理過的成骨細(xì)胞培養(yǎng)液， PBS緩沖液漂洗兩次，加入300 μL的細(xì)胞裂解液RIPA，待細(xì)胞充分裂解后收集裂解液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。將上述收集的?xì)胞裂解液于離心機(jī)中以12 000 r/min離心30 min，按BCA蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量。取適量蛋白經(jīng) SDS-PAGE 凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上用封閉液封閉。分別加入 1∶1 000 稀釋的一抗4 ℃過夜，次日分別加入1∶5 000 稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育 1 h，TBST 漂洗后，ECL 顯色，結(jié)果用圖像分析軟件Image Proplus 6.0分析灰度值，比較各組細(xì)胞中不同蛋白相對表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 加藥處理后細(xì)胞形態(tài)變化

加藥處理12 h時(shí)，將細(xì)胞置于倒置相差顯微鏡下觀察，各組細(xì)胞貼壁生長，呈三角形、紡錘形或多角形等形態(tài)正常，但細(xì)胞數(shù)目稀少(如圖1)；加藥處理24 h后，各組細(xì)胞數(shù)目明顯增多，而形態(tài)無明顯變化。初步表明淫羊藿苷納米微粒對成骨細(xì)胞形態(tài)無顯著影響。

圖1 藥物處理對成骨細(xì)胞形態(tài)的影響(上排：加藥12 h；下排：加藥24 h) (20×)Fig.1 Effect of drug treatment on the morphology of osteoblasts (upper row: 12 hour; lower row: 24 hour; 20×)

2.2 Hoechst 3342/PI 雙染色檢測細(xì)胞毒性

圖2所示，對照組細(xì)胞呈正常狀態(tài)，淫羊藿苷組和淫羊藿苷納米微粒組成骨細(xì)胞調(diào)亡或壞死的數(shù)量增多，但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 Hoechst 3342/PI 雙染色檢測細(xì)胞毒性結(jié)果 (20×)Fig.2 Cytotoxicity results of Hoechst 3342/PI double staining (20×)

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)成骨細(xì)胞中ALP活性測定結(jié)果(n=3)注： 與CON組相比，*P<0.05，**P<0.01；與ICA組相比，#P<0.05。Fig.3 ALP activity assay results of osteoblasts at different time points (n=3)

2.3 堿性磷酸酶活性測定結(jié)果

由圖3所示，加藥處理第3 d時(shí)，與對照組比較，淫羊藿苷組和淫羊藿苷納米微粒組的ALP 活性均升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；加藥第6 d時(shí)， 淫羊藿苷組ALP 活性顯著高于對照組(P<0.05)，淫羊藿苷納米微粒組ALP活性極顯著高于對照組(P<0.01)，且顯著高于淫羊藿苷組(P<0.05)，表明將淫羊藿苷制備成納米微粒后，其促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的能力顯著增強(qiáng)。

2.4 茜蘇紅鈣化結(jié)節(jié)染色結(jié)果

由圖4可知，對照組鈣化結(jié)節(jié)呈淡紅色，數(shù)量最少、面積最??；淫羊藿苷組呈橘紅色，鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量增加、面積增大；淫羊藿苷納米微粒組呈深橘紅色，鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量最多、面積最大，表明將淫羊藿苷制備成納米微粒后，其促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化的能力顯著增強(qiáng)。

圖4 藥物處理后鈣化結(jié)節(jié)染色結(jié)果 (20×)Fig.4 Calcified nodules stained by Alizarin red after 12 days of drug treatment (20×)

2.5 成骨特異性蛋白表達(dá)量的檢測結(jié)果

由于淫羊藿苷納米微粒能顯著增加成骨細(xì)胞ALP活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化成熟，表明淫羊藿苷納米微粒應(yīng)通過增加成骨細(xì)胞活性來促進(jìn)生長期大鼠骨量的。于是我們檢測了成骨細(xì)胞中Runx-2、OSX、CoL1α2和BMP-2等成骨特異性蛋白表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示這些蛋白的表達(dá)水平均顯著增加，且淫羊藿苷納米微粒組顯著高于淫羊藿苷組(圖5、6)。

3 討論

大量研究已經(jīng)表明，淫羊藿苷能夠促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的成熟與礦化，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞的骨吸收并誘導(dǎo)其凋亡[4]。Hsieh等[5]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷劑量依賴性地提高成骨細(xì)胞的增殖與礦化成熟。馬小妮等[6]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以上調(diào)OPG/RANKL的比值，從而抑制破骨細(xì)胞發(fā)生及其骨吸收活性。以上研究結(jié)果表明，淫羊藿苷能夠促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的骨形成、抑制骨吸收，具有潛在的、良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

圖5 通過Western印跡檢測成骨特異性蛋白表達(dá)量結(jié)果注：與CON組相比，*P<0.05，**P<0.01。Fig.5 Protein expression of osteogenic proteins as assessed with Western blotting

圖6 成骨性特異性蛋白表達(dá)的量化結(jié)果(n=3)Fig.6 Quantitative results of relative expression of osteogenic proteins(n=3)

本研究以自制的淫羊藿苷納米微粒為評估對象，考察其對體外培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細(xì)胞成熟與礦化的影響，并與淫羊藿苷原料藥相比較，從細(xì)胞水平上評價(jià)該遞釋系統(tǒng)是否可提高淫羊藿苷的生物利用度。

實(shí)驗(yàn)首先檢測了淫羊藿苷納米微粒對大鼠成骨細(xì)胞形態(tài)的影響，經(jīng)加藥處理細(xì)胞24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化情況。結(jié)果顯示，淫羊藿苷納米微粒組細(xì)胞狀態(tài)與對照組和淫羊藿苷組相比無明顯變化，初步表明淫羊藿苷納米微粒對成骨細(xì)胞無明顯不良反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用Hoechst 3342/PI雙染色法在熒光顯微鏡下觀察淫羊藿苷納米微粒對細(xì)胞凋亡和壞死的影響情況，由Hoechst 3342/PI染色原理可知，當(dāng)細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)，細(xì)胞染色質(zhì)固縮，Hoechst 3342 染料穿透細(xì)胞膜，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞呈亮藍(lán)色；同時(shí)由碘化丙啶 (PI)染色原理可知，弱紅色細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，強(qiáng)紅色細(xì)胞為壞死細(xì)胞[7]。由上述染色結(jié)果顯示淫羊藿苷納米微粒組亮藍(lán)色、亮紅色或弱紅色細(xì)胞數(shù)量雖然較多，但與對照組和淫羊藿苷原料藥組比較無明顯差異，再次表明淫羊藿苷納米微粒溶液對成骨細(xì)胞均無明顯的不良反應(yīng)。

堿性磷酸酶活性是成骨性分化的早期指標(biāo)之一，其數(shù)量和活性在成骨細(xì)胞的骨形成過程中直接影響骨形成能力[8]。而成骨細(xì)胞分化的最終結(jié)果是礦化成熟，因此，檢測成骨細(xì)胞中鈣鹽沉積量可揭示細(xì)胞礦化的進(jìn)度和程度。該實(shí)驗(yàn)中堿性磷酸酶活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定時(shí)間內(nèi)淫羊藿苷納米微?？娠@著提高成細(xì)胞中ALP活性，同時(shí)可增加鈣鹽沉積量，且效果顯著高于淫羊藿苷原料藥，表明淫羊藿苷納米微粒能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和礦化。

為了進(jìn)一步證明上述結(jié)果，實(shí)驗(yàn)還檢測了與成骨性相關(guān)的部分蛋白水平變化情況。OSX是一種成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，能促進(jìn)前成骨細(xì)胞分化為成熟的細(xì)胞[9]；BMP-2為骨形態(tài)發(fā)生蛋白，是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)骨細(xì)胞分化最重要的細(xì)胞外信號分子之一[10]。Runx-2在成骨細(xì)胞分化、成熟中也發(fā)揮重要作用，參與骨形成的早期階段[11]。淫羊藿苷納米微粒處理細(xì)胞24 h后，OSX、Runx-2、BMP-2等蛋白表達(dá)量較淫羊藿苷組明顯提高。OPG/RANKL 的比值決定了破骨細(xì)胞的命運(yùn)，比值降低則骨吸收增強(qiáng)，比值升高則骨吸收降低[12]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，淫羊藿苷納米微粒顯著提高了 OPG的表達(dá)量，而對 RANKL 表達(dá)無顯著影響，即淫羊藿苷納米微粒組 OPG/RANKL比值顯著高于對照組，表明淫羊藿苷納米微粒是通過促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收雙重作用來調(diào)節(jié)骨代謝的。

以上實(shí)驗(yàn)表明，淫羊藿苷納米微?？赡苁峭ㄟ^促進(jìn)ALP活性，增大鈣化結(jié)節(jié)面積，增加OSX、Runx-2、COL1α2、BMP-2等的蛋白表達(dá)量來促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成活性，且淫羊藿苷納米微粒的上述作用均強(qiáng)于淫羊藿苷原料藥，表明將淫羊藿苷原料藥制備為納米混懸液后， 其促進(jìn)骨形成的活性明顯提高了。其機(jī)理可能為：淫羊藿苷納米微粒作為一種新型藥物遞釋系統(tǒng)，具有粒徑小、載藥量高、黏附力強(qiáng)，且其載體本身易附著于細(xì)胞表面并與膜融合，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的效率更高，使細(xì)胞內(nèi)部藥物濃度較淫羊藿苷普通溶液提高，從而發(fā)揮了更高的藥效。這表明淫羊藿苷納米微?？赏蔀榭构琴|(zhì)疏松癥的新劑型，但其是否應(yīng)用于臨床還有待進(jìn)一步研究。