董萬濤 宋敏 鞏彥龍 董平 田杰祥 張亞彬 文浩楠

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是全身性糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)治療的常見并發(fā)癥，是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥最常見的原因，GC的臨床應(yīng)用所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)與骨骼脆弱性和骨折風(fēng)險增加有關(guān)[1]。臨床中糖皮質(zhì)激素被廣泛應(yīng)用于免疫性疾病、腎病、過敏性疾病、器官移植等疾病的治療中，其中骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生率高達(dá)41.4%[2]，還有更多的患者有潛在的OP發(fā)生的危險[3]。GC導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制復(fù)雜，研究[4]顯示，GC是骨形成和成骨細(xì)胞生成的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其對骨形成的抗合成作用與1型原膠原N-端前肽(procollagen type 1 N-terminal propeptide，P1NP)的快速抑制有關(guān)，并且其可直接通過抗成骨細(xì)胞合成和促進(jìn)成骨細(xì)胞代謝而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生[5]，目前對GIOP的病理機(jī)制主要從成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、內(nèi)分泌系統(tǒng)、鈣磷代謝及骨代謝相關(guān)因子等途徑展開，而從腸道菌群方面研究GIOP發(fā)生的機(jī)制尚未見報道，本研究從腸道菌群方面探討了GIOP的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

購自于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗室[SCXK(甘)2011-0001]的Wistar大鼠(雌雄各半)20只體重(180±20)g，在SPF級實驗室環(huán)境下(室溫20～24 ℃、相對濕度40%～65%、每天光照明暗各半)每五只飼養(yǎng)在同一籠中，每2天更換一次墊料，給予充足的水和食物。

1.2 試驗藥物、試劑與儀器

水合氯醛250 g/瓶(上海展云化工有限公司，生產(chǎn)批號：20151023)；VnF和VnR(10 μmol/L)(上海英俊生物技術(shù)有限公司)；dNTP Mix(10 mmol/L)(BioLabs)；Phusion HF MM(M0 541 L)和Phusion(BioLabs)；VAHTSTM DNA Clean(VAHTSTM)；Min Elute? PCR Purification Kit(QIAGEN)；100 bp DNA Ladder Marker(Ta Ta Ra)；Mobio 土壤微生物DNA強(qiáng)力提取試劑盒Power Soil? DNA Isolation Kit。96well PCR儀(AB，型號 9902)；24孔離心機(jī)(EPPENDORF，型號 5424EQ766751)。

1.3 方法

1.3.1動物分組及造模：20只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常組組(K組，10只)、模型組(MY組，10只)；模型組按人鼠等效劑量給予醋酸地塞米松片(成都第一制藥有限公司，規(guī)格0.75 mg×100片，國藥準(zhǔn)字H41021038，生產(chǎn)批號 170001)，每日0.5 mg/kg；連續(xù)給藥8周。正常組不做任何處理。

1.3.22組大鼠的糞便收集及糞菌總DNA的提取與檢測：模型成功后，兩組隨機(jī)抽取4只，10%水合氯醛腹腔注射麻醉并處死，剖開腹腔后在回盲部行“V”形切口，無菌鑷子夾取內(nèi)容物放入凍存管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?個樣品每個稱取0.3 g提取每個樣品糞便DNA、經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總DNA質(zhì)量，分光光度法測量DNA的純度及濃度，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.316srRNA擴(kuò)增子測序：以提取后樣本的DNA為模板，使用細(xì)菌16S rRNA(V3+V4)區(qū)域引物[6]：5′-ACTCCTACGG GAGGCAGCA-3′，5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′進(jìn)行擴(kuò)增及純化。

1.3.4腸道菌群物種注釋及功能預(yù)測：在物種注釋的基礎(chǔ)上，選每組樣本在門、綱、目、科、屬、種(Phylum、Class、Order、Family、Genus)分類水平上的豐度柱形累加圖；根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個樣品或分組在各分類水平(Phylum、Class、Order、Family、Genus、Species)上最大豐度排名前10的OTU，生成相對豐度柱形累加圖，以觀察各樣品在不同分類水平上的豐度；采用PICRUSt(Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States) 工具通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝途徑分析兩組的差異途徑，通過COG(Clusters of Orthologous Groups of Proteins)分析蛋白功能分類[7]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 2組腸道菌群的OTU分析

正常組與模型組組共同含有575個OUT數(shù)據(jù)，除共有的OUT之外正常組有12個不同的OUT數(shù)據(jù)，模型組有12個不同的OUT數(shù)據(jù)(圖1)。

圖1 2組大鼠腸道菌群的OTU分布的維恩(Venn)圖Fig.1 Venn diagram of OTU distribution of intestinal microflora in two groups of rats

2.2 2組樣本腸道菌群香農(nóng)指數(shù)曲線

當(dāng)香農(nóng)指數(shù)為3～4時，各樣本從隨機(jī)抽取的測序條數(shù)發(fā)現(xiàn)的物種趨于飽和(圖2)。

圖2 2組樣本腸道菌群香農(nóng)指數(shù)曲線Fig.2 Shannon index curve of intestinal flora in two groups of samples

2.3 NMDS分析

由圖可見，組間樣本距離較近組內(nèi)差異性小，而各組距離較遠(yuǎn)，組間差異較大，并且Stress=0.05<0.2，故此分析較可靠(圖3)。

圖3 NMDS分析圖注：圖中三角形代表正常組各樣本、圓圈代表模型組各樣本，當(dāng)Stress<0.2時，表明NMDS分析具有可靠性，在坐標(biāo)圖上兩組中各樣本間的距離越近說明該組樣本間的相似性越高。Fig.3 NMDS analysis chart

2.4 物種分布柱狀圖

如圖4所示，圖A為門水平(Phylum)、B為綱水平(Class)、C為目水平(Order)、D為科水平(Family)、E為屬水平(Genus)、F種水平(Species)；模型組大鼠在菌群結(jié)構(gòu)上發(fā)生了較大的改變，其中在門、綱、目水平螺旋菌(Spirochaetae)的相對豐度較正常組低，在綱、目、科水平丹毒絲菌(Erysipelotrichia)的相對豐度較正常組高，在門水平變形桿菌(Proteobacteria)、柔膜菌門(Tenericutes)的相對豐度較正常組高，在種、屬水平毛螺科菌(Uncultured-bacterium-f-lachnospiraceae)的相對豐度低于正常組，在屬水平疣微菌科UCG-005(Ruminococcaceae-UCG-005)、普雷沃菌科NK3B31群(Prevotellaceae-NK3B31-group)的相對豐度高于正常組，在種水平巴氏酵母種菌(Uncultured-balterium-f-Lachnospirraceae)、巴氏桿種菌(Uncultured-balterium-g-prevotella)的相對豐度高于正常組、而巴氏-G-羅馬尼亞梭菌-9(Uncultured-balterium-g-Ruminiclostridium-9)的相對豐度低于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 各個分類水平上各組物種的分布圖Fig.4 Percentile bar chart of species distribution at each taxonomic level

2.5 16S功能基因預(yù)測分析

2.5.1KEGG功能預(yù)測：通過KEGG代謝途徑的差異分析可見，模型組差異較明顯的途徑有外源性物質(zhì)的降解和代謝(xenobiotics biodegradation and metabolism)，細(xì)胞運(yùn)動(cell motility)，碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)，運(yùn)輸和分解代謝(transport and catabolism)，信號傳輸(signal tranabolism)，膜轉(zhuǎn)運(yùn)(membrane transport)，神經(jīng)系統(tǒng)(nervous system)，神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative disease)(圖5)。

圖5 KEGG功能預(yù)測圖Fig.5 KEGG function prediction chart注：圖5為不同功能在兩個樣品或者兩組樣品中的豐度比例，中間所示為95%置信度區(qū)間內(nèi)功能豐度的差異比例，最右邊的值為P值。

2.5.2COG功能預(yù)測：通過COG功能預(yù)測分析顯示，模型組差異較明顯的功能有細(xì)胞運(yùn)動(cell motility)、能量生產(chǎn)預(yù)測和轉(zhuǎn)換(energy production prediction and conversion)、防御機(jī)制(defense mechanisms)、未知功能(function unknown)、轉(zhuǎn)錄(transcription)、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(carbohydrate transport and metabolism)(圖6)。

圖6 COG功能預(yù)測圖Fig.6 COG function prediction chart注：通過比較圖5與圖6，發(fā)現(xiàn)每組有37個KEGG與22個COG功能預(yù)測分析的結(jié)果，且這些預(yù)測的結(jié)果在兩組中差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素連接內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)，并通過基因組和快速非基因組途徑確保組織修復(fù)、再生和病原體清除過程中的炎癥反應(yīng)而發(fā)揮功能，由于GC對免疫細(xì)胞、組織和器官有很強(qiáng)的免疫抑制、抗炎和抗過敏作用，盡管GC易導(dǎo)致OP等嚴(yán)重的并發(fā)癥，但由于其在臨床上的有效性和經(jīng)濟(jì)實用性，其仍然廣泛應(yīng)用于臨床[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，GC受體分布在成骨細(xì)胞上，該受體是GC作用于骨結(jié)構(gòu)的重要部位，GC的過度表達(dá)會使骨表面變厚而損害骨組織礦化，高于生理濃度的GC可抑制成骨細(xì)胞分化和增殖，加速成骨細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致骨形成延遲[10]。腸道細(xì)菌在人體健康中起著重要作用，共生腸道細(xì)菌對宿主有多種有益作用，包括促進(jìn)食物消化、產(chǎn)生必需營養(yǎng)素、增強(qiáng)腸道屏障完整性、完善宿主免疫系統(tǒng)和其他功能，GC能降低宿主的免疫力，導(dǎo)致腸道微生物群落組成及功能等實質(zhì)性變化，增加對病原體的敏感性[11]，而腸道菌群通過對鈣磷吸收、能量代謝、分解脂肪酸等復(fù)雜的途徑參與骨代謝的調(diào)節(jié)[12]，但是GC作用與腸道菌群對骨代謝產(chǎn)生影響進(jìn)而導(dǎo)致OP的發(fā)病機(jī)制尚未見報道。

為了進(jìn)一步探討GIOP與腸道微生物之間的關(guān)系，本研究采用16SrRNA技術(shù)，分析了地塞米松喂養(yǎng)建立骨質(zhì)疏松模型大鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化及功能變化，從腸道微生態(tài)角度對GIOP的發(fā)生機(jī)制做以探討。分析結(jié)果顯示，模型組大鼠在菌群結(jié)構(gòu)個水平上發(fā)生了較大的變化，其中在門、綱、目水平Spirochaetae的相對豐度較正常組低，在綱、目、科水平Erysipelotrichia的相對豐度較正常組高，在門水平Proteobacteria、Tenericutes的相對豐度較正常組高，在種、屬水平Uncultured-bacterium-f-lachnospiraceae的相對豐度低于正常組，在屬水平Ruminococcaceae-UCG-005、Prevotellaceae-NK3B31-group的相對豐度高于正常組，在種水平Uncultured-balterium-f-Lachnospirraceae、Uncultured-balterium-g-prevotella的相對豐度高于正常組、Uncultured-balterium-g-Ruminiclostridium-9的相對豐度低于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。長期服用GC后在腸道菌群中擬桿菌和普雷沃菌處于高水平，這與它們攝取高蛋白及碳水化合物的代謝途徑相關(guān)[13]，而本研究中普雷沃菌與正常組比較處于高水平，并且其代謝途徑和功能都涉及到碳水化合物。長期服用GC可引起體內(nèi)脂質(zhì)積聚、腸道菌群結(jié)構(gòu)改變和結(jié)腸黏液分泌減少，這些生理變化的機(jī)制可能包括晝夜節(jié)律紊亂和糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)表達(dá)失調(diào)。Wu 等[15]研究顯示，長期外源性GC導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺軸(he hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA axis)的長期激活狀態(tài)是內(nèi)源性GC的分泌發(fā)生改變，這與腸道微生物群變化有關(guān)，GC治療導(dǎo)致了高豐度水平的變形桿菌、酵母菌、螺旋菌，這與“促炎癥及免疫”相關(guān)；另一方面，GC導(dǎo)致腸道菌群的變化使腸組織中黏液分泌水平發(fā)生變化，進(jìn)而上調(diào)結(jié)腸抗菌肽相關(guān)基因(如TLR-2和defa8)的轉(zhuǎn)錄水平，GC誘導(dǎo)的炎癥與免疫反應(yīng)是腸道微生物群結(jié)構(gòu)變化的直接因素[15]，而OP的發(fā)生與腸道免疫系統(tǒng)密切相關(guān)[16]。

模型組差異較明顯的KEGG代謝途徑有xenobiotics biodegradation and metabolism、cell motility、carbohydrate metabolism、transport and catabolism、signal tranabolism、membrane transport、nervous system、neurodegenerative disease等，差異較明顯的COG功能有cell motility、energy production prediction and conversion、defense mechanisms、function unknown、transcription、carbohydrate transport and metabolism等。研究顯示，碳水化合物參與的能量轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝在GIOP的發(fā)生過程中具有重要的作用，而骨鈣素的能量轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝調(diào)節(jié)作用參與了在這一過程中[17]；在GIOP的病理過程中神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮了重要作用，神經(jīng)系統(tǒng)可通過多種骨代謝相關(guān)信號通路(如OPG/RANK/RANKL信號通路)P物質(zhì)、神經(jīng)肽Y促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及向成骨細(xì)胞的分化和礦化以促進(jìn)成骨作用、通過β2腎上腺素受體，參與交感神經(jīng)系統(tǒng)對骨重建的調(diào)控作用，以抑制骨量的丟失[18]；而免疫細(xì)胞本身作為破骨細(xì)胞的前體參與骨代謝[19]；在本研究中16S rRNA分析得出GIOP模型大鼠腸道菌群的功能及通路主要有能量轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫功能等，與上述研究相符合。

綜上，本研究成功復(fù)制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松模型，應(yīng)用16S rRNA技術(shù)，分析了模型組和正常組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能的變化情況，對從腸道菌群方面闡明GIOP發(fā)病、病理變化機(jī)制和進(jìn)一步深入研究及指導(dǎo)治療具有重要意義。隨著腸道菌群對機(jī)體健康機(jī)制的逐步闡明，從腸道菌群方面預(yù)防和治療疾病的思路及方法受到越來越多學(xué)者的關(guān)注與重視，這為進(jìn)一步從“腸-骨軸”方面研究防治OP提供了便利。但是，腸道菌群本身是一個非常復(fù)雜的器官，其對機(jī)體的調(diào)節(jié)更是全方位、多途實現(xiàn)的，所以其對GIOP復(fù)雜的調(diào)節(jié)及防治機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。