余麗金 溫廣宇* 崔紅旺

1. 海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院，海南 ?？?57000 2. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 海口 57000

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是絕經(jīng)后女性發(fā)生較多的一種全身性骨病，以骨量減少及骨組織微結(jié)構(gòu)病變?yōu)榕R床特征，可增加骨骼脆性，易引發(fā)骨折，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。OP發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但已有研究表明，其發(fā)病與骨代謝異常有關(guān)。研究顯示，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)是作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的成員，可募集人間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells，hMSC)至骨折部位，改變hMSC遷移、侵襲能力，其具有治療骨質(zhì)疏松性骨折的潛力[2]。另外，骨鈣素(osteocalcin，OCN)是非膠原酸性糖蛋白之一，在骨鈣代謝中發(fā)揮重要作用，其在卵巢低反應(yīng)患者中呈低水平，采用溫陽補(bǔ)腎法結(jié)合運(yùn)動指導(dǎo)可有效提高OCN，減少患者發(fā)生OP的風(fēng)險(xiǎn)[3]。但BMP-7、OCN在OP患者血清中的水平與患者骨代謝指標(biāo)及骨密度的關(guān)系研究鮮少。本研究旨在分析絕經(jīng)后OP患者BMP-7、OCN水平與骨代謝有關(guān)指標(biāo)及骨密度的相關(guān)性，從而為臨床防治OP提供一定參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

選取2017年5月至2019年3月于本院診治的絕經(jīng)女性O(shè)P患者93例為OP組，其中年齡50～70歲；身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)為(18.69～26.15) kg/m2，絕經(jīng)時(shí)間3～15年，所有患者符合《中國人骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)專家共識》[4]有關(guān)OP判定標(biāo)準(zhǔn)。OP患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均進(jìn)行骨密度(bone mineral density，BMD)檢查確診；②自愿參與本項(xiàng)研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨腫瘤、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、甲狀腺功能亢進(jìn)等疾病者；②合并肝、腎、心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者；③一年內(nèi)進(jìn)行卵巢摘除、發(fā)生骨折者；④合并雌激素依賴性腫瘤者；⑤近期服用過鈣制劑、肝素、雌激素、維生素D等影響骨代謝的藥物者。并以同期來我院進(jìn)行體檢健康的絕經(jīng)女性86例為對照組，其中年齡49～68歲，BMI為(18.73～26.34)kg/m2，絕經(jīng)時(shí)間3～14年。

所有受試者或其家屬簽署知情同意書，所用研究方法符合倫理學(xué)要求，且經(jīng)本院倫理委員會審核、批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol Reagent(貨號：S30876)購買于上海源葉生物科技有限公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(貨號：69001-3)購買于上海子起生物科技有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix(貨號：JK-R2010)購買于上海晶抗生物工程有限公司；人骨特異性堿性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase，BAP)酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購買于美國METRI生物系統(tǒng)公司；人I型膠原交聯(lián)氨基末端肽(type I collagen cross-linked opeptide，NTX)ELISA試劑盒購買于Ostex International 公司。

紫外分光光度計(jì)(型號：DU-730)購買于上海普迪生物技術(shù)有限公司；ABI 7500Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：StepOne TM)購買于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(上海)；雙能X線骨密度儀(型號：Prodigy型)購買于通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)貿(mào)易發(fā)展(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1樣本采集與預(yù)處理：收集兩組受試者清晨空腹肘靜脈血5～6 mL，自然凝集，3 600 r/min離心8 min，收集上層血清，分裝，于-80 ℃冰箱中保存，待檢。

1.3.2qRT-PCR法檢測血清BMP-7、OCN表達(dá)水平：將血清樣本從-80 ℃冰箱中取出，凍融，參考TRIzol試劑盒說明書抽提總RNA，檢測其濃度、純度及完整性。依據(jù)Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書配制反應(yīng)體系，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后，參照擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒2x SYBR Green qPCR Master Mix說明書配制反應(yīng)體系，在一定條件下進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。BMP-7、OCN以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCT計(jì)算兩者表達(dá)水平，其相應(yīng)引物序列如表1。

表1 BAP、NTX及內(nèi)參GAPDH的引物序列Table 1 Primer sequences of BAP, NTX, and GAPDH

1.3.3ELISA法檢測血清BAP、NTX水平：取出凍存血清樣本，解凍，嚴(yán)格按照BAP、NTX ELISA試劑盒說明書檢測兩組受試者血清BAP、NTX水平。

1.3.4骨密度檢測：受試者側(cè)臥于檢查床，使其脊柱與掃描檢查床平行屈髖屈膝，腰椎平靠側(cè)位定位器，受試者右拳放于床面，右臂與肩部垂直，與檢查床呈90°，利用雙能X線骨密度儀檢測腰椎(L2-L4)、股骨頸、Ward三角區(qū)及大轉(zhuǎn)子的BMD，取其平均值即為受試者個(gè)體BMD。參考文獻(xiàn)[5]，儀器檢測骨密度精度<1%變異系數(shù)，X射線管最大管電壓76 kV。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

與對照組相比，OP組患者雌二醇水平明顯降低(P<0.05)，年齡、BMI、絕經(jīng)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 兩組一般資料比較Table 2 Comparison of general data between the two groups

2.2 兩組血清BMP-7、OCN、骨代謝指標(biāo)、BMD水平比較

與對照組相比，OP組患者血清BMP-7、OCN、BAP/NTX、BMD表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，OP組患者BAP、NTX水平明顯升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組血清BMP-7、OCN、骨代謝指標(biāo)、BMD水平比較Table 3 Comparison of serum BMP-7, OCN, bone metabolism index, and BMD between the two groups

2.3 OP患者血清BMP-7、OCN表達(dá)水平與骨代謝相關(guān)指標(biāo)及BMD的相關(guān)性

Pearson法分析顯示，OP患者血清BMP-7表達(dá)水平與BAP、NTX均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與BAP/NTX、BMD均呈正相關(guān)(P<0.05)；OP患者血清OCN表達(dá)水平與BAP、NTX均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，

與BAP/NTX、BMD均呈正相關(guān)(P<0.05)。詳見表4。

2.4 OP患者血清BMP-7表達(dá)水平與OCN的關(guān)系

Pearson法分析顯示，OP患者血清BMP-7表達(dá)水平與OCN水平呈正相關(guān)(r=0.531，P<0.05)。詳見圖1。

表4 OP患者血清BMP-7、OCN表達(dá)水平與骨代謝指標(biāo)、BMD的相關(guān)性

圖1 OP患者血清BMP-7表達(dá)水平與OCN的關(guān)系Fig.1 The relationship between the level of serum BMP-7 expression and OCN in OP patients

2.5 影響OP的Logistic回歸分析

以雌二醇、BAP、NTX、BAP/NTX、BMD為自變量，以是否發(fā)生OP為因變量，行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，雌二醇、BMD是影響OP發(fā)生的保護(hù)險(xiǎn)因素(P<0.05)，BAP、NTX是影響OP發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。詳見表5。

表5 Logistic回歸分析OP的影響因素

3 討論

絕經(jīng)后OP是臨床常見的由內(nèi)分泌、遺傳、物理等多種因素所致的一種代謝性骨病，其致殘率、致死率均高，對女性生命安全及健康構(gòu)成極度威脅[6]。因此，尋找可早期診治評估OP的有效指標(biāo)，并動態(tài)監(jiān)測指標(biāo)水平，對改善生存質(zhì)量具有積極意義。

BMP-7是廣泛分布于血液、骨膜、骨膠原纖維、骨髓基質(zhì)中的轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員，在骨和軟骨細(xì)胞分化，骨和軟骨的形成、發(fā)育、缺損修復(fù)等生物學(xué)過程中具有重要調(diào)控作用[7-8]。Schwarting等[9]通過研究發(fā)現(xiàn)僅在BMP-7刺激的牛腱標(biāo)本、原代成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等培養(yǎng)物中出現(xiàn)組織的骨化區(qū)和碳酸鈣樣結(jié)構(gòu)，BMP-7對體外肌腱-骨整合的生物學(xué)過程具有積極作用，其對治療韌帶損傷具有潛在的輔助價(jià)值。另有研究顯示，BMP-7在骨折患者血清中表達(dá)異常，經(jīng)丹參注射液治療后，其水平表達(dá)上調(diào)，BMP-7可促進(jìn)骨間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化，促使鈣鹽沉積，形成新骨，其可能參與并影響骨折愈合過程[10]。以上研究表明，BMP異常表達(dá)可能與骨形成、代謝、修復(fù)等關(guān)系密切。本研究中OP組患者血清BMP-7表達(dá)下調(diào)，提示BMP-7可能在OP發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮一定作用。猜測絕經(jīng)后女性卵巢功能減退、雌激素顯著減少，雌激素可能影響B(tài)MP-7表達(dá)，BMP-7進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的分化及活性，從而在OP過程中起一定作用。雌激素如何影響B(tài)MP-7表達(dá)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

OCN主要是由骨細(xì)胞分泌的一種維生素K依賴性鈣結(jié)合蛋白，與成骨活性密切相關(guān)，在骨鈣代謝中起重要作用，可一定程度反映骨形成、骨轉(zhuǎn)化的程度，其對診斷鈣代謝異常、OP等疾病具有重要價(jià)值[11-12]。相關(guān)研究顯示OCN在原發(fā)性O(shè)P女性患者血清中呈異常表達(dá)，與BMD具有一定相關(guān)性，其水平有利于診斷絕經(jīng)后OP[13]。另有研究指出，OCN在老年OP患者血清中呈低水平，經(jīng)唑來膦酸治療后，其水平顯著上升，OCN可能在老年OP發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮一定作用[14]。以上研究證實(shí)，表達(dá)異常的OCN可能與各種OP骨代謝疾病有關(guān)。本研究中OP組患者血清OCN表達(dá)水平明顯降低，與俞菁等[14]研究趨勢相符，提示OCN可能參與并影響OP發(fā)生發(fā)展過程。推測OCN可能降低骨細(xì)胞的活性，影響骨形成及骨吸收的平衡，進(jìn)而影響OP發(fā)病過程。

在正常骨代謝中，成骨細(xì)胞形成新骨與破骨細(xì)胞吸收舊骨構(gòu)成動態(tài)平衡，進(jìn)行骨重建，一旦骨吸收超過骨形成，會引起OP。BAP是一種位于成骨細(xì)胞表面的特異性糖蛋白，可反映成骨細(xì)胞的活性，是具有較好診斷效能的骨形成指標(biāo)，而NTX是骨I型膠原特異性降解的低分子肽，是較好的骨吸收生物標(biāo)志物[15-16]，兩者比值可助于鑒別個(gè)體是否易患OP及是否存在快速骨量丟失。本研究顯示，OP組患者BAP、NTX水平明顯升高，BAP/NTX比值明顯降低，提示BAP、NTX均可能參與絕經(jīng)女性O(shè)P疾病的發(fā)展，且OP疾病以NTX代表的骨吸收占主要優(yōu)勢，兩者水平檢測有助于判定是否發(fā)生OP及病情評估。國內(nèi)外研究認(rèn)為，OP患者BMD水平明顯低于正常人，BMD是判定OP發(fā)生的常用指標(biāo)。本研究顯示，BMD在OP患者中水平明顯降低，與前人研究[17]一致，提示BMD水平有助于評估OP病情進(jìn)展程度。

本研究通過分析OP患者血清BMP-7、OCN水平與骨代謝及BMD指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示，BMP-7、OCN表達(dá)水平均與BAP、NTX呈負(fù)相關(guān)，與BAP/NTX、BMD呈正相關(guān)，提示BMP-7、OCN可能與BAP、NTX、BMD相互作用，協(xié)同影響OP發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步研究顯示BMP-7在OP患者血清中的表達(dá)水平與OCN呈正相關(guān)，提示，兩者可能相互影響，從而共同在OP發(fā)展過程中起作用。此外，研究顯示雌二醇、BMD是影響OP發(fā)生的保護(hù)險(xiǎn)因素，BAP、NTX是影響OP發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示雌二醇、BMD水平降低，BAP、NTX升高均有可能增加OP發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)監(jiān)控雌二醇、BMD、BAP、NTX水平有助于及早防治OP。

綜上所述，BMP-7、OCN在OP患者血清中呈低表達(dá)，兩者與骨代謝指標(biāo)BAP、NTX及BMD具有一定相關(guān)性，兩者可能在OP患者的骨代謝中發(fā)揮作用。但本研究取樣較少，可能會導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)一定程度偏差，后期將加大樣本量進(jìn)行更深入的探究。