王志剛 劉菊

武漢市第一醫(yī)院老年病科，湖北 武漢 430000

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP)是目前臨床中常見的2型糖尿病合并癥，患者多表現(xiàn)為骨脆性增高、骨強(qiáng)度減弱、單位骨量減少和骨組織細(xì)微結(jié)構(gòu)變化等全身性骨質(zhì)病變[1]。有研究指出，2型糖尿病的多種并發(fā)癥中DOP是最為常見的多發(fā)性骨骼系統(tǒng)并發(fā)癥，一般情況下在出現(xiàn)DOP后患者極易出現(xiàn)骨折等不良預(yù)后的發(fā)生[2]。目前臨床中多采用增強(qiáng)骨密度和控制血糖等常規(guī)對(duì)癥方案進(jìn)行干預(yù)治療，雖然其可有效改善患者主要癥狀，但對(duì)致病環(huán)境和體質(zhì)改善的影響存在一定不足，且長(zhǎng)時(shí)間治療極易導(dǎo)致患者出現(xiàn)多種不良反應(yīng)[3]。有研究指出，胰島β細(xì)胞功能減退在2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過程中起到十分重要的作用[4]。miRNA在胰島β細(xì)胞功能調(diào)控過程中起到十分重要作用，可有效維持并調(diào)節(jié)體內(nèi)葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡[5]。利拉魯肽是經(jīng)典的GLP-1類似物，可有效促進(jìn)胰島素的合成與分泌，加速胰島素的生物合成[6]。但利拉魯肽在DOP中的應(yīng)用仍鮮有報(bào)道，因而筆者構(gòu)建DOP大鼠模型分析利拉魯肽對(duì)大鼠miRNA-19a、miRNA-144及骨密度的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究中選擇使用SPF級(jí)健康4～6周齡雌性SD大鼠，體質(zhì)量(162.6±7.4)g，所有大鼠均置于25～28 ℃條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水進(jìn)食，自然采光通風(fēng)，所有大鼠飼料及墊料均購(gòu)買自南京青龍山動(dòng)物繁育場(chǎng)。

1.2 分組方法造模

1.2.1DOP大鼠造模方法：將50只大鼠依照體重編號(hào)，后采用隨機(jī)數(shù)表法將所有大鼠隨機(jī)分為4組，分別為正常組、去勢(shì)對(duì)照組、模型組及給藥組，正常組及去勢(shì)對(duì)照組10只，模型組及給藥組各15只。正常組及去勢(shì)對(duì)照組大鼠使用普通飼料飼養(yǎng)，模型組及給藥組大鼠均給予高脂飼料飼養(yǎng)，4周后禁食12 h，去勢(shì)對(duì)照組、模型組及給藥組均進(jìn)行去勢(shì)，且均采用手術(shù)方法將卵巢切除，后縫合肌肉和皮膚，并使用青霉素干預(yù)抗炎，后模型組及給藥組大鼠均使用2%鏈脲佐菌素依照35 mg/kg劑量腹腔注射干預(yù)，正常組注射等量的檸檬酸鹽緩沖液，72 h后采用斷尾取血法檢測(cè)大鼠空腹血糖值，若血糖值≥16.7 mmol/L則判定造模成功。造模完成后持續(xù)性高脂高糖喂養(yǎng)7周，后采用雙能X線骨密度檢測(cè)儀對(duì)骨密度進(jìn)行測(cè)定，若造模后大鼠骨密度低于正常組的2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差則判定DOP造模成功。

1.2.2干預(yù)方法：本組研究中在造模完成后模型組及給藥組分別隨機(jī)選擇大鼠10只，后依照分組方法進(jìn)行治療。給藥組大鼠采用利拉魯肽進(jìn)行治療，依照每天一次每次0.1 mg/kg劑量皮下注射干預(yù)，4周后依照每天1次，每次0.2 mg/kg的劑量皮下注射，持續(xù)治療12周。正常組、去勢(shì)對(duì)照組及模型組均依照相同的給藥方法給予生理鹽水干預(yù)。

1.3 觀察指標(biāo)

本研究中在治療結(jié)束后采集大鼠血液樣本，檢測(cè)大鼠空腹血糖及胰島素水平。將大鼠使用乙醚麻醉，后使用雙能X線骨密度檢測(cè)儀對(duì)骨密度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過程中固定四肢，后保持雙側(cè)股骨水平，椎體豎直，后測(cè)定腰椎、全身、骨盆及股骨骨密度。采用Western blot法檢測(cè)各組大鼠血中鈣黏蛋白11(Cad-11，抗體批號(hào)：181202-1)及胰島素受體底物1(IRS1，抗體批號(hào)：181023)水平，以Cad-11/GAPDH和IRS-1/GAPDH表示Cad-11及IRS1表達(dá)水平，所用抗體均購(gòu)買自CST公司，一抗抗體稀釋比為1∶1 000，二抗抗體稀釋比1∶200。并采集大鼠血液樣本，采用Trizol法提取總RNA后采用PT-PCR法檢測(cè)血中miRNA-19a及miRNA-144水平，測(cè)定miRNA的Ct值，并計(jì)算2-△Ct值計(jì)為基因表達(dá)量，所用PCR引物均購(gòu)買自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究使用SPSS 20.0行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用百分率和均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)數(shù)和計(jì)量資料，后行卡方和方差檢驗(yàn)分析組間數(shù)據(jù)差異，采用LSD-t檢驗(yàn)表示兩組間數(shù)據(jù)差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖及胰島素水平檢測(cè)結(jié)果

四組大鼠血糖及胰島素水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中正常組中大鼠空腹血糖最低而胰島素最高，給藥組空腹血糖及胰島素水平均明顯優(yōu)于模型組及去勢(shì)對(duì)照組，詳見表1。

表1 各組大鼠血糖及胰島素水平檢測(cè)結(jié)果

2.2 各組大鼠miRNA-19a及miRNA-144水平檢測(cè)結(jié)果

四組大鼠miRNA-19a及miRNA-144水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中正常組中大鼠miRNA-19a及miRNA-144水平最低，且給藥組大鼠miRNA-19a及miRNA-144水平明顯低于模型組及去勢(shì)對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 各組大鼠miRNA-19a及miRNA-144水平檢測(cè)結(jié)果

2.3 各組大鼠Cad-11及IRS1水平檢測(cè)結(jié)果

四組大鼠Cad-11及IRS1水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中正常組中大鼠Cad-11及IRS1水平最高，給藥組Cad-11及IRS1水平明顯高于模型組及去勢(shì)對(duì)照組，且差異存統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表3。

2.4 各組大鼠骨密度值檢測(cè)結(jié)果

四組大鼠全身、胸腰椎、雙側(cè)股骨盆骨及腰椎部

位骨密度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中正常組中各部位骨密度最高，給藥組各部位骨密度明顯高于去勢(shì)對(duì)照組和模型組(P<0.05)，詳見表4。

表3 各組大鼠Cad-11及IRS1水平檢測(cè)結(jié)果

圖1 WB檢測(cè)圖Fig.1 WB detection chart

表4 各組大鼠骨密度值檢測(cè)結(jié)果Table 4 Bone mineral density of rats in each

3 討論

OP是較為常見的以骨微結(jié)構(gòu)改變、骨量降低為主要特診的一類疾病，OP發(fā)生后極易導(dǎo)致骨脆性增加并導(dǎo)致骨折的出現(xiàn)，屬于常見的全身性代謝疾病[7]。雖然有學(xué)者認(rèn)為糖尿病和OP屬于獨(dú)立性疾病，糖尿病是導(dǎo)致OP發(fā)生與發(fā)展的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素，患者在出現(xiàn)糖尿病后并發(fā)OP的概率顯著升高[8]。此外，有流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，與同性別、同年齡的人群相比較，糖尿病患者OP及骨質(zhì)減少發(fā)生率均顯著升高，雖然其發(fā)病機(jī)制尚未完全揭示，但有研究認(rèn)為其和糖尿病患者長(zhǎng)時(shí)間胰島素分泌量不足、高血糖、多臟器病變、神經(jīng)及血管系統(tǒng)病變等多種因素密切相關(guān)[9]。此外，糖尿病患者的飲食控制、長(zhǎng)期服用降糖藥物、胰島素樣生長(zhǎng)因子、雌激素、體重、瘦素、年齡及性別等因素均可能在DOP的發(fā)生及發(fā)展過程中扮演十分重要的角色。

DOP的發(fā)生及發(fā)展過程中胰島細(xì)胞的功能及數(shù)量減退在其中起到十分重要的作用，傳統(tǒng)的對(duì)癥治療藥物無法有效調(diào)控胰島細(xì)胞的分化、增殖等功能，且無法有效調(diào)控骨代謝失衡[10]。GLP-1類似物可有效加速修復(fù)胰島細(xì)胞，改善骨代謝。利拉魯肽是經(jīng)典的GLP-1類似物藥物，GLP-1屬于有以高血糖素原前體經(jīng)酶加工后而來的腸促胰島素，是由20個(gè)氨基酸構(gòu)成的由L細(xì)胞釋放，可有效抑制胰高血糖素的釋放并改善胰島素的分泌量[11]。利拉魯肽是化學(xué)合成的GLP-1類似物，在對(duì)2型糖尿病進(jìn)行治療時(shí)具有較高的臨床療效，利拉魯肽可有效控制血糖、減輕體質(zhì)量，屬于治療糖尿病的新藥[12]。有學(xué)者采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可有效正性調(diào)節(jié)骨代謝，間接或直接作用于骨細(xì)胞，降低骨硬化蛋白水平，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路[13]。而miRNAs是參與細(xì)胞修復(fù)和骨代謝調(diào)控的重要內(nèi)源性物質(zhì)基礎(chǔ)，在DOP病情發(fā)生及發(fā)展過程中起到十分重要的作用。有研究指出，miRNA-19a、miRNA-144是機(jī)體內(nèi)重要的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受體的靶基因，其參與體內(nèi)胰島素生物學(xué)功能的調(diào)控[14]。因而本研究中選擇利拉魯肽作為受試藥，分析其對(duì)DOP大鼠miRNA-19a、miRNA-144及骨密度的影響。

本研究結(jié)果顯示，去勢(shì)對(duì)照組的血糖高、胰島素水平降低，分析認(rèn)為，去勢(shì)對(duì)照組大鼠將雙側(cè)卵巢摘除后可能導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)病理性改變，引起體內(nèi)內(nèi)分泌系統(tǒng)異常，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)代謝異常進(jìn)而導(dǎo)致血糖水平升高，并影響胰島素代謝，降低其中胰島素水平。使用利拉魯肽治療后可顯著改善大鼠血糖及胰島素水平，有效調(diào)控miRNA-19a、miRNA-144的表達(dá)的同時(shí)提高Cad-11及IRS1水平。此外，對(duì)大鼠各部位的骨密度進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示，采用利拉魯肽治療后顯著改善大鼠全身、胸腰椎、雙側(cè)股骨盆骨及腰椎骨密。分析認(rèn)為，DOP大鼠采用利拉魯肽治療后可顯著改善其血中胰島素及血糖水平，其與GLP-1類似物的作用原理密切相關(guān)。有學(xué)者[15]研究結(jié)果顯示，miRNA-19a、miRNA-144是調(diào)節(jié)胞內(nèi)Cad-11及IRS1基因表達(dá)，并通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄RNA及蛋白翻譯和修飾，而Cad11及IRS1在骨代謝過程中起到十分重要的作用。本研究結(jié)果提示，利拉魯肽可通過有效調(diào)控體內(nèi)miRNA-19a、miRNA-144表達(dá)水平提高Cad-11及IRS1表達(dá)進(jìn)而起到逆轉(zhuǎn)骨形成與骨代謝失衡，有效加速骨質(zhì)生成進(jìn)而提高大鼠各部位的骨密度。本研究結(jié)果提示，在臨床中可采用利拉魯肽對(duì)糖尿病骨質(zhì)疏松癥患者進(jìn)行治療干預(yù)，有助于提高治療質(zhì)量。

綜上所述，利拉魯肽可有效降低2型DOP大鼠miRNA-19a、miRNA-144水平，并提高大鼠骨密度。但本研究并未對(duì)利拉魯肽對(duì)DOP大鼠基因表達(dá)譜的影響進(jìn)行深入研究分析，仍有待后續(xù)深入分析研究。