郭楊 王禮寧 馬勇* 鄭蘇陽(yáng) 潘婭嵐 孫杰 司譽(yù)豪 涂鵬程 徐桂華

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷修復(fù)與重建新技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科，江蘇 南京 210029 3.南京中醫(yī)藥大學(xué)慢性病中醫(yī)護(hù)理干預(yù)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)就是由于骨形成和骨吸收失衡所造成的一種以骨密度降低、骨脆性增加為特征的全身性骨骼疾病[1]。其導(dǎo)致的脆性骨折等并發(fā)癥將嚴(yán)重影響中老年人的生活質(zhì)量，已成為全球性的健康問(wèn)題。目前，市面上常見(jiàn)的抗骨質(zhì)疏松藥物如雙膦酸類(lèi)、雌激素受體類(lèi)藥均有吸收性差、不良反應(yīng)較多的缺陷。因此，往往無(wú)法取得令人滿意的療效。

中醫(yī)藥已被證明具有抗骨質(zhì)疏松潛能的天然產(chǎn)物備受人們的關(guān)注。蛇床子素(Osthole，OST)，作為中藥蛇床子中一種主要的活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、護(hù)肝、抗腫瘤、延緩老年癡呆等藥理作用[2-4]。本課題組前期體外研究發(fā)現(xiàn)：一方面，OST可以通過(guò)激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而刺激成骨細(xì)胞的增殖、分化，并最終促進(jìn)新骨形成[5]；另一方面，OST也可以通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)而引起NFATc1等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的下調(diào)來(lái)抑制破骨細(xì)胞的分化成熟[6]。然而，由于OST難溶于水且吸收性差，常造成藥物生物利用度下降，為克服這些問(wèn)題，課題組借助中醫(yī)學(xué)“相須”理論和“藥食同源”理念，合成了未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的新型蛇床子素/殼聚糖衍生物膠束(Osthole-loaded N-octyl-O-sulfonyl chitosan micelles, NSC-OST)，并初步在體外觀察了其藥效[7-8]，但其在體內(nèi)藥理作用的發(fā)揮尚需要進(jìn)一步研究。因此，本文計(jì)劃通過(guò)建立去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型，初步觀察其對(duì)大鼠骨微結(jié)構(gòu)與骨吸收現(xiàn)象的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)未經(jīng)產(chǎn)的3月齡雌性SD大鼠共40只，體重為(200±15)g，由南京市江寧區(qū)青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證書(shū)：SCXK(蘇)2012-0008。本研究項(xiàng)目的所有開(kāi)展過(guò)程已得到南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(項(xiàng)目編號(hào)：ACU170804)。

1.2 試劑與儀器

試劑：蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，HPLC>99.8%)；蛇床子素/殼聚糖衍生物膠束(NSC-OST)由中國(guó)藥科大學(xué)合成并提供；尼爾雌醇(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；抗酒石酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(美國(guó) SIGMA公司)；鼠抗大鼠NFATc1單克隆抗體(貨號(hào)：sc-7294)、鼠抗大鼠CTSK單克隆抗體(貨號(hào)：sc-48353)、鼠抗大鼠c-Fos單克隆抗體(貨號(hào)：sc-166940)，購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司；二甲苯、HE染液、切片石蠟、脫鈣液、多聚甲醛(南昌雨露病理生化試劑公司)；注射用青霉素鈉(四川制藥有限公司)、羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥)。

儀器：倒置相差顯微鏡CKX31型(日本 Olympus光學(xué)儀器株式會(huì)社)；小動(dòng)物Micro CT測(cè)試儀1176型(比利時(shí) Skyscan公司)；全自動(dòng)硬組織切片機(jī)RM2265型(德國(guó) 徠卡公司)；生物組織冷凍臺(tái)YD-6 L型、生物組織包埋機(jī)YD-6 L型、生物組織烤片機(jī)YD-B型、組織染色機(jī)YD-700型，購(gòu)自中國(guó)金華益迪公司。

1.3 動(dòng)物造模與分組給藥

造模方法：術(shù)前10 h禁食，手術(shù)當(dāng)天用2.5%的戊巴比妥鈉按照30 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔麻醉，于肋下2 cm進(jìn)行常規(guī)消毒，于脊柱兩側(cè)旁開(kāi)約1.5 ～2 cm處行2 cm左右的切口，逐層剝離，找到桑葚樣的卵巢后進(jìn)行結(jié)扎并切除，術(shù)后3 d肌注青霉素預(yù)防傷口感染。

分組方法：分組及各組給藥劑量具體如下：①假手術(shù)組給予等體積生理鹽水(0.5%羧甲基纖維素鈉)；②模型組給予等體積生理鹽水(0.5%羧甲基纖維素鈉)；③尼爾雌醇組按照1 mg/(kg.week)給藥一次，每次給藥3 mL，其余時(shí)間給予上述同體積溶劑灌胃；④蛇床子素組按照10 mg/(kg.d)給藥，每天給藥3 mL；⑤蛇床子素/殼聚糖衍生物膠束組按照100 mg/(kg.d)(OST的載藥量為10%，OST實(shí)際含量保持一致)，每天給藥3 mL；上述組別均連續(xù)灌胃12周后，麻醉后雙側(cè)脛骨和股骨-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Micro-CT

根據(jù)之前文獻(xiàn)報(bào)道的協(xié)議[9]，設(shè)定CT掃描參數(shù)為分辨率9 μm、電壓65 kV、電流384 mA和1 mm濾鏡。掃描結(jié)束后，使用系統(tǒng)內(nèi)置的軟件Nrecon 1.6和CTAn 1.14對(duì)每一個(gè)標(biāo)本選取統(tǒng)一的感興趣區(qū)域(regions of interest, ROI)：距髁間窩生長(zhǎng)板0.5 mm，長(zhǎng)3 mm的一段松質(zhì)骨進(jìn)行重構(gòu)，使用建模軟件CTan分析構(gòu)建二維與三維圖像，采用上述軟件進(jìn)一步分析骨松質(zhì)形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)，包括骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、三維骨密度(3D BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.5 HE染色

將左側(cè)股骨置于4%多聚甲醛中固定24 h后，用10% EDTA溶液脫鈣4～6周，脫鈣完成以針刺無(wú)阻力感為標(biāo)準(zhǔn)；截取1.5 cm左右股骨遠(yuǎn)端部分，并進(jìn)行乙醇梯度脫水；二甲苯溶液透明；常規(guī)石蠟包埋；切取石蠟切片厚度為5 μm，常規(guī)行HE染色，中性樹(shù)脂封片，倒置顯微鏡下觀察骨組織的微形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6 TRAP染色

按照試劑盒說(shuō)明配置新鮮的TRAP染液，將空白的石蠟切片放入預(yù)熱37 ℃的染液中避光浸染1 h，然后用蘇木精染液復(fù)染細(xì)胞核，蒸餾水漂洗、中性樹(shù)脂封片后，顯微鏡下觀察并采集圖像后用圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0分析單位骨小梁面積破骨細(xì)胞數(shù)(number of osteoclasts per bone surface, N. Oc/BS)和單位骨小梁破骨細(xì)胞面積比(osteoclast surface per bone surface, Oc. S/BS)。

1.7 免疫組化

將石蠟切片置于二甲苯溶液中脫蠟10 min，乙醇梯度(高至低：100%、95%、80%、70%)各2 min水化，先后用蒸餾水、PBS溶液漂洗3 min；室溫下用預(yù)熱的封閉通透液避光浸潤(rùn)切片30 min，PBS溶液漂洗兩次，3 min/次；檸檬酸鈉溶液抗原修復(fù)，微波爐里高火4 min至沸騰，然后自然冷卻至室溫，PBS溶液洗3次，3 min/次；血清封閉37 ℃溫箱中30 min；一抗孵育4 ℃過(guò)夜，PBS漂洗3次，3 min/次；二抗孵育37 ℃ 1～2 h，PBS洗3次，3 min/次；DAB顯色，顯色后終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染30 s，水漂洗 15 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片；置于顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 NSC-OST對(duì)股骨三維形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的影響

Micro-CT掃描和三維重建是用來(lái)評(píng)估大鼠模型中的骨微觀結(jié)構(gòu)變化的有效手段。其中模型組對(duì)比假手術(shù)組表現(xiàn)出明顯的骨小梁流失。然而，對(duì)比模型組，口服NSC-OST可明顯提高大鼠的BMD和BV/TV(P<0.05)，并明顯改善Tb.N、Tb.Sp、Tb.Th三項(xiàng)指標(biāo)(P<0.05)(圖1-A、1-B)，總體效果要優(yōu)于OST組，但略遜于Nil組。表1。

2.2 NSC-OST對(duì)股骨組織病理學(xué)形態(tài)的影響

根據(jù)圖2結(jié)果顯示，Sham組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)均勻分布，排列整齊并互相連接呈網(wǎng)狀，形態(tài)較為完整；Ovx組骨小梁結(jié)構(gòu)明顯變細(xì)，骨皮質(zhì)變薄，形態(tài)結(jié)構(gòu)性差，有扭曲和斷裂的現(xiàn)象，骨質(zhì)疏松樣改變典型。Nil、 OST組和NSC-OST組經(jīng)過(guò)治療后，骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改善明顯，其中Nil組骨微結(jié)構(gòu)的改善效果最明顯，NSC-OST組次之，最后是OST組。具體表現(xiàn)為骨小梁稍細(xì)，排列尚整齊，排列部分呈網(wǎng)狀，間隙略大，形態(tài)結(jié)構(gòu)基本完整。

2.3 NSC-OST對(duì)股骨組織中破骨細(xì)胞數(shù)量的影響

染色結(jié)果顯示，OVX組的破骨細(xì)胞較假手術(shù)組明顯增多，OST和NSC-OST能明顯抑制破骨細(xì)胞的生成，NSC-OST的抑制效果更明顯(圖3)。采用Image-J進(jìn)行圖像分析顯示，模型組N. Oc/BS和Oc. S/BS較假手術(shù)組受到明顯抑制(P<0.05)，藥物組均能一定程度的改善這兩項(xiàng)參數(shù)(P<0.05)，其中Nil組改善效果最明顯，NSC-OST組次之，然后則是OST組(表2)。以上結(jié)果提示NSC-OST能在體內(nèi)外均顯著的抑制破骨細(xì)胞的生成和活性。

圖1 NSC-OST對(duì)大鼠三維股骨微結(jié)構(gòu)的影響注：A 股骨矢狀面骨結(jié)構(gòu)的二維掃描圖； B 股骨骨微結(jié)構(gòu)的三維建模圖。Fig.1 Effect of NSC-OST on 3D femoral microstructure in rats

表1 NSC-OST對(duì)股骨三維形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的影響Table 1 Effect of NSC-OST on 3D bone morphometrics

圖2 各組股骨組織的HE染色結(jié)果(100×)Fig.2 HE staining results of femoral tissues in each group(100×)

2.4 NSC-OST對(duì)股骨組織中破骨細(xì)胞特異性分子的影響

股骨遠(yuǎn)端的免疫組化結(jié)果顯示，OVX組中的NFATc1、c-fos、CTSK的表達(dá)較假手術(shù)組均顯著增強(qiáng)，但Nil、OST、NSC-OST組干預(yù)后均能發(fā)揮不同程度地抑制作用。其中，Nil組和NSC-OST組在抑制NFATc1、c-fos方面效果較好，二者作用相當(dāng)；Nil組抑制CTSK的作用最強(qiáng)，而OST組和NSC-OST組在該指標(biāo)上作用相似，見(jiàn)圖4。

圖3 各組股骨組織的TRAP染色結(jié)果(200×)Fig.3 TRAP staining results of femoral tissues in each group(200×)

表2 NSC-OST對(duì)股骨破骨細(xì)胞數(shù)量參數(shù)的影響

圖4 NSC-OST對(duì)破骨特異性標(biāo)志分子NFATc1、c-Fos、CTSK的作用(n=3，200×)Fig.4 Effects of NSC-OST on osteoclast-specific molecules NFATc1, c-Fos, and CTSK in rat femurs (n=3, 200×)

3 討論

配伍是中藥處方的靈魂，而“相須”配伍作為復(fù)方中最常見(jiàn)的一種配伍方式，指的是性能功效相類(lèi)似的兩種藥物配伍使用后可以增強(qiáng)某種或幾種組成的治療效應(yīng)，本文中NSC-OST的合成制備思路正是來(lái)源于中醫(yī)“相須”配伍的理論。另外，骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)藥防治講究“藥食同源”，常以動(dòng)物的殼或骨用作藥膳食材，而殼聚糖則正是來(lái)源于魚(yú)蝦蟹殼的主要成分——甲殼素，其來(lái)源廣泛，并可通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾形成兩親性聚合物膠束，產(chǎn)生一定的親骨性，再通過(guò)物理包埋藥物，增溶難溶性藥物，提高生物利用度[10]。同時(shí)，殼聚糖也具有促進(jìn)骨形成效應(yīng)的生物學(xué)作用，且已在骨組織工程中得到了一定范圍的應(yīng)用[11]。因此，基于OST在抗骨質(zhì)疏松上表現(xiàn)出的良好前景，課題組前期成功制備了具有良好親水性的NSC-OST，并在本文中進(jìn)一步觀察其對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型的藥理學(xué)效應(yīng)。

Micro-CT掃描可以得到松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的骨三維圖像，具有相當(dāng)高的分辨率，通過(guò)軟件分析可以較精確地測(cè)得骨量及相關(guān)骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)，是目前檢測(cè)骨質(zhì)疏松嚴(yán)重程度的最佳技術(shù)手段之一。造模后3D BMD、BV/TV的降低表示了骨量的下降，OST可以一定程度提高模型組的3D BMD、BV/TV值，而NSC-OST則強(qiáng)化了這一作用。Micro-CT還可直接分析獲取骨小梁的參數(shù)，包括：Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp等，這些數(shù)據(jù)均提示了卵巢切除術(shù)可導(dǎo)致骨小梁數(shù)量減少，骨質(zhì)進(jìn)一步流失。而OST可一定程度上拮抗失去卵巢所引起的骨質(zhì)疏松，但效果仍不如Nil。NSC-OST則進(jìn)一步強(qiáng)化了OST的效果，可更有效地逆轉(zhuǎn)骨小梁的減少，減緩骨質(zhì)疏松的疾病進(jìn)程。

而HE染色也驗(yàn)證了以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示NSC-OST可以顯著改善大鼠股骨的骨微結(jié)構(gòu)；同時(shí)綜合大鼠股骨的TRAP染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NSC-OST可以明顯抑制N. Oc/BS和Oc. S/BS，抑制破骨細(xì)胞的生成，提示NSC-OST的抗骨質(zhì)疏松效應(yīng)可能和抑制破骨細(xì)胞分化的能力有關(guān)。

NFATc1是破骨細(xì)胞形成和分化過(guò)程中不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子之一[12-14]。此外，NFATc1在破骨細(xì)胞的骨吸收功能的激活中也發(fā)揮了重要的作用[15]。NFATc1敲除的胚胎干細(xì)胞將無(wú)法成功分化為破骨細(xì)胞，然而破骨前體中NFATc1的異位表達(dá)又能使其在RANKL缺失的條件下成功分化，靶向破壞小鼠造血細(xì)胞中的NFATc1能使破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，骨量顯著增加[16]。c-Fos作為NFATc1上游的重要調(diào)控分子，同時(shí)也是一種必不可少的RANK/RANKL通路下游轉(zhuǎn)錄因子[17]，c-Fos純合子小鼠可表現(xiàn)為由于破骨細(xì)胞缺失而引起一系列骨硬化等功能障礙[18]。CTSK作為破骨細(xì)胞分泌的一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，骨骼中的膠原蛋白等其他基質(zhì)可在骨吸收的過(guò)程中被其溶解。相關(guān)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，CTSK突變的情況存在于常染色體隱形骨壞死患者(骨硬化癥)，這一現(xiàn)象也符合高密度情況下的分子診斷結(jié)果[19]。本研究結(jié)果表明：造模后的大鼠股骨骨中破骨特異蛋白NFATc1、c-Fos和CTSK表達(dá)量明顯上調(diào)，而NSC-OST可抑制上述蛋白的表達(dá)上調(diào)，NFATc1、c-Fos蛋白表達(dá)的抑制作用NSC-OST組與Nil組相當(dāng)，而NSC-OST抑制CTSK與的作用則不如Nil組，與OST組相似。

綜上，NSC-OST在體內(nèi)良好藥效的發(fā)揮，也進(jìn)一步揭示了其作為一種安全有效的抗骨質(zhì)疏松藥物的潛能。本研究證明了在中醫(yī)經(jīng)典理論指導(dǎo)下合成的NSC-OST，其顯著的抗骨質(zhì)疏松的效應(yīng)發(fā)揮與其對(duì)破骨細(xì)胞及其骨吸收的抑制作用有關(guān)，但其具體分子機(jī)制仍待進(jìn)一步探究。