趙宇明,張 悅，代 亮，張立民

(1.秦皇島市第一醫(yī)院 泌尿外科,河北 秦皇島066000；2.秦皇島市婦幼保健院 婦科,河北 秦皇島066000)

前列腺癌屬于一種在臨床上較為常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，流行病學(xué)調(diào)查顯示，此病多發(fā)于中老年男性人群，目前隨著臨床上對前列腺癌的深入研究發(fā)現(xiàn)，此病的發(fā)生與年齡、種族和地理位置、遺傳與家族史、雄激素、代謝綜合征、生活習(xí)慣、飲食、基因等多因素相關(guān)[1,2]。手術(shù)、放療、化療等手段為前列腺癌的主要治療方式，雖然在一定程度上改善患者癥狀，但部分患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，其原因可能與癌細(xì)胞異常增殖、遷移、侵襲相關(guān)[3,4]。本文分析miR-135a靶向調(diào)控STAT6對前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

DU145前列腺癌細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所提供。主要試劑：miR-135a NC、Hsa-miR-135a均由上海吉瑪公司提供；Lipofectamine 2000試劑由Invitrogen公司提供；Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由美國GeneCopoeia提供；MTT試劑盒由艾美捷科技有限公司提供；小鼠抗大鼠MMP-2抗體、兔抗大鼠MMP-9抗體均由武漢益普生物科技有限公司提供；小鼠抗大鼠TIMP-2抗體由艾美捷科技有限公司提供；兔抗人Bcl-2抗體由上海雅吉生物科技有限公司提供；兔抗大鼠Bax抗體由武漢益普生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將DU145前列腺癌細(xì)胞株采用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基在溫度為37℃、5% CO2、95%飽和濕度條件的孵育箱中做培養(yǎng)處理，根據(jù)細(xì)胞生長情況采用0.25%胰蛋白酶每周做傳代處理，處理2次，當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定進(jìn)入至對數(shù)生長期時用于后續(xù)試驗。待細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿底80%左右時，加2.5 g/L胰蛋白酶給予消化，1∶3傳代，采集對數(shù)生長的第一代細(xì)胞，分為空白組、miR-135a陰性對照組、miR-135a轉(zhuǎn)染組3組。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 三組細(xì)胞每孔設(shè)置為3個復(fù)孔，分別加入100 μl 1×105個/mL細(xì)胞濃度的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，空白組加入常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液、生理鹽水做空白處理，miR-135a陰性對照組加入miR-135a NC、Lipofectamine 2000試劑行無義序列轉(zhuǎn)染，miR-135a轉(zhuǎn)染組加Hsa-miR-135a、Lipofectamine 2000試劑行轉(zhuǎn)染。

1.2.3細(xì)胞miR-135a、STAT6 mRNA表達(dá)量檢測 采用熒光定量RT-PCR技術(shù)鑒定miR-135a轉(zhuǎn)染效率，并檢測STAT6 mRNA表達(dá)量。取細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA純度、含量，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物序列，采用2-△△Ct方法計算。反應(yīng)體系：0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYB Green，加蒸餾水至20 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min、94℃ 30 s、60℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 5 min，共進(jìn)行30個循環(huán)。miR-135a引物序列：上游：5’-CCGACGCGTTCTTTTCTGTTGCCCCATC-3’，下游：5’-CCCA-AGCTTGGACCGCAGCACCTATCT-3’；STAT6引物序列：上游：5’-AGGAGAGCAGGGGAAAGGAAG-3’，下游：5’-TGGCAGGTGGTGGAACTC-TT-3’。內(nèi)參基因U6引物序列：上游：5’-CTCGC-TTCGGCAGCACA-3’，下游：5’-AACGCTTCAC-GAATTTGCGT-3’。

1.2.4細(xì)胞增殖檢測 使用MTT比色法檢測三組細(xì)胞增殖情況，在細(xì)胞培養(yǎng)后將細(xì)胞濃度調(diào)整至3×104個/ml，接種于96孔板中，將200 μl細(xì)胞懸液加入至每孔中，在37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入10 μl MTT試劑繼續(xù)孵育4 h，采用酶標(biāo)儀測定波長為570 nm的細(xì)胞組OD值，計算三組細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(細(xì)胞組OD值/參照組OD值)×100%。

1.2.5細(xì)胞凋亡檢測 使用DxFLEX流式細(xì)胞儀、Annexiv-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，檢測各組細(xì)胞凋亡情況，采用PBS重復(fù)洗滌細(xì)胞2次，取另一支試管，加入70%預(yù)冷的乙醇5 ml，用吸管吸取細(xì)胞懸液迅速吹入固定劑中(乙醇)振蕩混勻，4℃冰箱固定至少18 h。將離心固定后的細(xì)胞，用PBS洗2次，細(xì)胞濃度調(diào)整為為1×106個/ml，取1 ml，離心處理后將上清液棄除，加入1 ml PI染液，4℃冰箱避光染色30 min后上機(jī)檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處熒光。

1.2.6細(xì)胞遷移檢測 采用細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力，實驗步驟：將細(xì)胞接種至18孔板待其增長到80%時，使用100 μl的槍頭,垂直劃出3條直線，使用PBS緩沖液清洗2-3次，分別加入0.5 %的血清培養(yǎng)基，觀察24 h之后，使用倒置顯微鏡觀察三組細(xì)胞的遷移數(shù)量。

1.2.7細(xì)胞侵襲檢測 采用Transwell小室檢測三組細(xì)胞侵襲能力，培養(yǎng)板中放置Transwell小室，細(xì)胞懸液接種于上室，100 ng/ml IL-8接種于下室，24 h后100 μg/ml TMP溶液入至下室，孵育24 h，將上室微孔中的細(xì)胞使用棉簽擦除，PBS反復(fù)洗滌3次(每次洗滌3 min)后，將其固定于4%多聚甲醛溶液中，固定處理15 min，使用蘇木精染色處理10 min，再次使用PBS洗滌，在倒置顯微鏡下觀察上室微孔下層的細(xì)胞數(shù)，觀察三組細(xì)胞侵襲能力。

1.2.8MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白檢測 采用Western Blot法檢測細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量，將細(xì)胞行10000×g離心處理10 min，對上清液進(jìn)行提取后，BCA進(jìn)行蛋白定量檢測，在2×SDS凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100℃環(huán)境中加熱5 min。凝膠電泳完轉(zhuǎn)膜，取膜，4 ℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時間為1 h，一抗使用0.05%-0.1% TBST稀釋(MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax一抗為1∶1000)，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%-0.1% TBST洗膜，3次，每次為5 min，二抗被0.05%-0.1% TBST稀釋(1∶10000)，搖動孵育時間為 1 h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，處理時間為5 min，DAB顯色，定量分析蛋白表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率鑒定結(jié)果

如表1所示，與空白組相比，miR-135a陰性對照組miR-135a表達(dá)量降低，miR-135a轉(zhuǎn)染組miR-135a表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明miR-135a轉(zhuǎn)染成功。

2.2 三組細(xì)胞STAT6 mRNA表達(dá)量對比

如表2所示，空白組、miR-135a陰性對照組、miR-135a轉(zhuǎn)染組STAT6 mRNA表達(dá)量比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與miR-135a陰性對照組相比，miR-135a轉(zhuǎn)染組STAT6 mRNA表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 轉(zhuǎn)染效率鑒定結(jié)果

表2 三組細(xì)胞STAT6 mRNA表達(dá)量對比

2.3 三組細(xì)胞增殖、凋亡情況比較

如表3所示，空白組、miR-135a陰性對照組、miR-135a轉(zhuǎn)染組增殖、凋亡率比較，空白組、miR-135a轉(zhuǎn)染組均比miR-135a陰性對照組miR-135a轉(zhuǎn)染組增殖率降低，凋亡率升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 三組細(xì)胞增殖、凋亡情況比較

2.4 三組細(xì)胞侵襲、遷移情況比較

如表4、圖1-2所示，空白組、miR-135a陰性對照組、miR-135a轉(zhuǎn)染組侵襲、遷移個數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與miR-135a陰性對照組相比，miR-135a轉(zhuǎn)染組侵襲、遷移個數(shù)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 三組細(xì)胞侵襲、遷移情況比較

圖1 三組細(xì)胞侵襲能力比較

圖2 三組細(xì)胞遷移能力比較

2.5 三組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量比較

如表5、圖3所示，空白組、miR-135a陰性對照組、miR-135a轉(zhuǎn)染組MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與miR-135a陰性對照組相比，miR-135a轉(zhuǎn)染組MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達(dá)量降低，TIMP-2、Bax蛋白表達(dá)量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表5 三組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

3 討論

微小RNA(miRNA)屬于一類較為重要的具有調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、應(yīng)激的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA分子，在轉(zhuǎn)錄水平上可調(diào)控多種基因的表達(dá)，使其降解和抑制翻譯過程[5]。目前臨床上隨著對前列腺癌的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，miRNA異常表達(dá)與此病的發(fā)生密切相關(guān)，可經(jīng)調(diào)控基因表達(dá)發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤形成、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移過程。miR-135a為miR-135家族成員之一，其具有抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-135a在喉癌[7]、膠質(zhì)瘤[8]、胃癌[9]、非小細(xì)胞肺癌[10]中異常表達(dá)，其可經(jīng)一系列的作用途徑促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，抑制癌細(xì)胞凋亡。Xu B等[11]在其研究中發(fā)現(xiàn)激素依賴前列腺癌組織中miR-135a的表達(dá)均高于激素非依賴前列腺癌組織，推測miR-135a表達(dá)異常亦可能與前列腺癌進(jìn)展有關(guān)。本研究中構(gòu)建miR-135a慢病毒載體，轉(zhuǎn)染至前列腺癌細(xì)胞中，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-135a后的前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力均被顯著抑制，且凋亡率顯著升高，提示，miR-135a與前列腺癌進(jìn)展相關(guān)，提高其表達(dá)抑制癌細(xì)胞增殖、遷移，阻止疾病惡化，提高患者生存周期。

圖3 三組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量WB圖

STATs屬于一類與細(xì)胞生長分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞免疫反應(yīng)、惡性腫瘤發(fā)生的一種DNA結(jié)合蛋白，當(dāng)其與分布于細(xì)胞表面的細(xì)胞因子受體發(fā)生特異性結(jié)合后會出現(xiàn)酪氨酸殘基磷酸化，形成二聚體，使其被激活，從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，對其相應(yīng)的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生誘導(dǎo)作用[12,13]。STAT6為STAT家族成員之一，其相對分子量大約為94×103，可經(jīng)作用于JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)多種細(xì)胞因子活化，參與機(jī)體多種生理病理變化過程，最終促進(jìn)疾病的發(fā)生[14,15]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-135a作用的靶基因為STAT6。本文研究結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-135a培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞STAT6表達(dá)量顯著降低，此結(jié)果提示miR-135a可能經(jīng)抑制STAT6表達(dá)，發(fā)揮其抑制癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)凋亡的作用。

細(xì)胞增殖、凋亡過程與多基因相互作用相關(guān)，Bcl-2家族與此密切相關(guān)，Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，兩者相互作用，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，抑制癌細(xì)胞凋亡[16,17]。本文結(jié)果顯示，miR-135a轉(zhuǎn)染的前列腺癌細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)明顯改善，提示著miR-135a轉(zhuǎn)染抑制前列腺癌細(xì)胞遷移、侵襲增殖的機(jī)制可能與作用于STAT6，調(diào)控MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax表達(dá)相關(guān)。