周佳冰，張雅卿，劉雙平，徐岳正，周建弟，毛 健，

（1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室,江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122；2.江蘇省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院食品生物技術(shù)研究所（如皋江大食品生物技術(shù)研究所有限公司），江蘇南通 226500；3.國家黃酒工程技術(shù)研究中心,浙江古越龍山紹興酒股份有限公司,浙江紹興 312000）

黃酒作為中華民族歷史最悠久、最古老的特色酒精飲料，是以稻米、黍米、小米、玉米、小麥、水等為主要原料，經(jīng)加曲和部分酶制劑、酵母等糖化發(fā)酵劑釀制而成的發(fā)酵酒，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒[1-3]。黃酒酒性柔和，酒味醇厚，蛋白質(zhì)種類豐富，并且富含氨基酸等多種營養(yǎng)成分[4-5]。

高級醇是含3個以上碳原子的醇類的總稱，是酒類發(fā)酵過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，主要由釀酒酵母代謝所產(chǎn)生[14]，芳香醇則是帶有苯環(huán)的高級醇，主要包括β-苯乙醇、酪醇與色醇，是黃酒中主要的風(fēng)味物質(zhì)，黃桂東等[11]對不同年份半干型紹興酒分析發(fā)現(xiàn)，高級醇中β-苯乙醇對香氣的貢獻最大。釀酒酵母體內(nèi)芳香醇的合成主要通過Ehrlich途徑和莽草酸途徑[16-19]，莽草酸途徑合成芳香醇代謝途徑長、存在多種抑制作用，這也使得酵母通過該途徑合成芳香醇的量一般都偏低。較高含量的芳香醇會產(chǎn)生一定的致醉性，但適量的芳香醇可以賦予黃酒特有的醇香、豐滿圓潤和協(xié)調(diào)的口感[6-10]；而料酒作為以黃酒為主要原料的調(diào)味品，在烹調(diào)過程中具有增加食物香味的作用[12-13]，也需要控制適宜的芳香醇含量。

不同的酵母菌種的生理特性各不相同，在發(fā)酵過程中代謝副產(chǎn)物的種類及含量存在顯著差異[15]，為了有效控制黃酒中芳香醇的含量，探究黃酒酵母與釀酒酵母模式菌產(chǎn)芳香醇差異及原因是非常有必要的。本文通過比較芳香醇高產(chǎn)菌株黃酒酵母HJ與釀酒酵母模式菌株BY4743在黃酒發(fā)酵過程中(前酵0～120 h，后酵120～480 h)的理化指標、芳香醇與氨基酸的動態(tài)變化，探究黃酒酵母產(chǎn)芳香醇差異及影響因素，為黃酒中芳香醇的調(diào)控提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：生麥曲、熟麥曲，古越龍山紹興酒股份有限公司；粳糯米，市售。

菌種：黃酒酵母HJ，古越龍山紹興酒股份有限公司；模式菌株BY4743，由實驗室保存。

試劑及耗材：β-苯乙醇、色醇、酪醇、甲醇等均為色譜純；氯仿、異戊醇、冰乙酸、三氯乙酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；糖化酶（120000 U/mL）、液化酶（120000 U/mL），蘇州宏達制酶有限公司。

儀器設(shè)備：高效液相色譜Waters e2695，美國沃特世公司；Trace 1300 ISQ單四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司；超聲清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；金屬浴，杭州奧盛儀器有限公司；小型高速離心機，賽默飛世爾科技有限公司；水浴恒溫振蕩器，太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；全自動立式蒸汽滅菌器，馳通儀器（上海）有限公司；pH計，瑞士Mettler Toledo公司；紫外可見光分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酒制作

（1）酵母的活化

配制一定量的YPD培養(yǎng)基，分裝，115 ℃滅菌20 min；按8 ‰的接種量將甘油保藏管的酵母菌（黃酒酵母HJ與模式菌BY4743）分別轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，在無菌操作臺進行轉(zhuǎn)接；將轉(zhuǎn)接好的酵母在30 ℃，200 r/min條件下，培養(yǎng)24 h，備用。

（2）酒母的培養(yǎng)

米飯、水按1∶4比例混合，加入液化酶（1.1‰）、糖化酶（1.1‰）和生麥曲（10%）進行液化與糖化，溫度控制在60 ℃，時間3～4 h，糖化結(jié)束后外觀糖度不低于12°Bx，115 ℃滅菌20 min，待冷卻至24～31 ℃，分別接入（1）中培養(yǎng)成熟的酵母種子培養(yǎng)液5%，培養(yǎng)溫度不超過31 ℃，培養(yǎng)時間20 h，培養(yǎng)成熟后備用。

（3）蒸飯

稱取一定量的米，加入常溫自來水，浸泡1 d。將蒸鍋中的水燒開，取一定量的米均勻分散在紗布之上，蒸煮10 min，后用85 ℃以上的熱水進行噴灑，將噴灑后的米飯再次蒸煮10 min，準備出鍋。將蒸好的米飯攤冷，準備落料。

（4）落料

按照表1配方將米飯、自來水、生麥曲、熟麥曲、酒母同時加入，并混合均勻，兩個發(fā)酵體系除酒母外均保持一致。前發(fā)酵：28 ℃恒溫發(fā)酵5 d，前5 d每天開耙不少于1次，頭耙時間8～10 h。后發(fā)酵：后酵時間15 d，后酵控制溫度15 ℃±2 ℃。每2 d攪拌開耙1次。

表1 黃酒發(fā)酵體系

（5）發(fā)酵與取樣

按照（4）中發(fā)酵體系及發(fā)酵溫度進行發(fā)酵，黃酒酵母HJ與模式菌BY4743均取3個平行。分別在發(fā)酵24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、216 h、288 h、360 h、480 h時間點取樣，共計10次。

1.2.2 理化指標的測定

總酸采用酸堿滴定法、氨基態(tài)氮采用甲醛滴定法進行測定，具體方法見GB/T 13662—2018《黃酒》；還原糖含量的測定采用DNS法[22]。

1.2.3 HPLC測定酪醇與色醇

（1）標準溶液的配制

以水為溶劑，配制酪醇600 mg/L、色醇600 mg/L的混合標準儲備溶液。將混合標準儲備溶液分別稀釋100倍、50倍、10倍、2倍后進樣，以峰面積為橫坐標，標準物質(zhì)濃度為縱坐標，進行線性回歸。

（2）色譜條件

色譜柱：XBridge C18(250×4.6 mm，5 μm)；檢測波長280 nm。采用峰面積外標法定量；柱溫：30 ℃；流速：0.75 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：甲醇∶水∶冰乙酸（50∶49∶1）。

（3）樣品的處理

取10 mL樣品12000 r/min離心10 min，取3 mL上清液與3 mL的10 %三氯乙酸溶液混合，渦旋混勻1 min，于4 ℃下靜置4 h，取上清液1 mL過0.22 μm有機濾膜后可直接進樣測定。根據(jù)標準曲線回歸方程計算樣品中的芳香醇含量。

1.2.4 β-苯乙醇的測定

采用氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）測定黃酒樣品中的β-苯乙醇含量，樣品預(yù)處理方法以及檢測方法參照已有文獻[23]。

1.2.5 發(fā)酵醪中20種游離氨基酸與水解氨基酸含量的測定方法

（1）游離氨基酸處理方法

利用異硫氰酸苯酯衍生劑與游離氨基酸進行衍生反應(yīng)，采用HPLC測定發(fā)酵醪中游離氨基酸，具體方法參照文獻[27]。

（2）酸水解氨基酸測定方法

稱取150 mg左右均質(zhì)后的黃酒發(fā)酵醪于水解管中，加8 mL HCl（6 mol/L）搖勻，充氮氣3 min，擰緊水解管，放入120 ℃烘箱水解22 h，將水解管樣品轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加4.8 mL NaOH（10 mol/L）中和，定容至25 mL，雙層濾紙過濾，取1 mL澄清液離心(15000 r/min，30 min)，上清液過膜待測，測定方法同1.2.5.1。

（3）堿水解氨基酸(色氨酸)測定方法

稱取150 mg均質(zhì)后的黃酒發(fā)酵醪于水解管中，加8 mL NaOH（5 mol/L）搖勻，充氮氣3 min，擰緊水解管，放入120 ℃烘箱水解22 h，將水解管樣品轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加6.7 mL HCl（6 mol/L）中和，定容至25 mL，雙層濾紙過濾，取1 mL澄清液離心(15000 r/min，30 min)，上清液過膜待測，測定方法同1.2.5(1)。

1.2.6 酸性蛋白酶活力測定

酸性蛋白酶活力的測定參考《工業(yè)酶制劑通用試驗方法》，定義1 g黃酒發(fā)酵醪在30 ℃、pH 3.0的條件下，1 min水解酪蛋白為1 μg酪氨酸，為1個酶活力單位，單位是U/g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品設(shè)3個平行，采用Excel 2013和origin 2018軟件進行數(shù)據(jù)處理，測試結(jié)果以平均值±標準差來表示；采用R 3.5.1中的corrplot包繪制相關(guān)性分析圖；SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程理化指標變化曲線

不同的酵母有著不一樣的發(fā)酵特性[15]，因此它們在相同條件下發(fā)酵產(chǎn)生的酒精度等理化指標也有著一定的差異。由圖1可知，黃酒酵母HJ還原糖的消耗速率明顯快于模式菌BY4743，黃酒酵母HJ在發(fā)酵第96 h還原糖已消耗殆盡，而模式菌BY4743直到120 h才被消耗完；黃酒酵母HJ具有較高的發(fā)酵效率，在發(fā)酵結(jié)束時其酒精度比模式菌BY4743高1 %vol左右；氨基態(tài)氮的含量均隨著發(fā)酵時間的延長而升高，在發(fā)酵結(jié)束時達到最高。結(jié)果表明，黃酒酵母HJ在黃酒發(fā)酵過程中還原糖消耗能力與產(chǎn)酒精能力要強于模式菌株BY4743。

2.2 總氨基酸與游離氨基酸的變化

2.2.1 黃酒發(fā)酵過程總氨基酸變化

黃酒中的氨基酸是一類重要的營養(yǎng)素，主要來自原料及微生物的代謝作用[30]，且酵母能夠利用氨基酸通過Ehrilch途徑合成相應(yīng)的醇[17]。由表2可知，黃酒在發(fā)酵初期有較為豐富的總氨基酸，黃酒酵母HJ與模式菌BY4743在發(fā)酵過程中總氨基酸均有一定的降低，進一步分析發(fā)現(xiàn)，在HJ的黃酒體系中總氨基酸的消耗量達到1.208 g/L，高于BY4743(0.696 g/L)，與模式菌BY4743相比，黃酒酵母HJ發(fā)酵醪中苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸的消耗量分別提高了65.3%、34.9%、76.5%。說明黃酒酵母HJ對于氨基酸的利用能力要高于模式菌BY4743。

2.2.2 黃酒發(fā)酵過程中游離氨基酸的變化

從圖2可知，兩株酵母發(fā)酵液中游離氨基酸的含量均隨發(fā)酵時間的延長而增加，其中黃酒酵母HJ中的游離氨基酸在發(fā)酵結(jié)束時達到2700 mg/L，是模式菌BY4743的1.5倍。游離氨基酸在前酵期間的增加是由發(fā)酵醪中酵母產(chǎn)生的蛋白酶水解原料中的氨基酸導(dǎo)致的，而后酵期間游離氨基酸的增加是由于后酵期間部分酵母菌自溶，伴隨著大量氨基酸和多肽產(chǎn)生[25]。

在黃酒發(fā)酵體系中，氨基酸釋放的量主要由發(fā)酵醪中游離氨基酸的含量和微生物消耗的氨基酸含量組成。由圖2可知，發(fā)酵結(jié)束后，黃酒酵母HJ發(fā)酵醪中芳香族游離氨基酸含量達到0.38 g/L，結(jié)合2.2.1中芳香族氨基酸的消耗量0.315 g/L可知，黃酒酵母HJ發(fā)酵醪中芳香族氨基酸的釋放量為0.695 g/L，芳香族游離氨基酸的釋放率達25.16%，其中有45.32 %的芳香族游離氨基酸被HJ用于自身代謝與芳香醇的合成，同理可知，BY4743的芳香族游離氨基酸釋放率只有10.75%，其中有41.75%被BY4743用于自身代謝與芳香醇的合成。黃酒酵母HJ的芳香族游離氨基酸釋放率是模式菌BY4743的2.34倍，說明相比較于模式菌BY4743，黃酒酵母HJ有更高的氨基酸釋放率。

表2 發(fā)酵醪中總氨基酸含量變化

2.3 發(fā)酵過程芳香醇變化曲線

芳香醇是酵母合成細胞蛋白質(zhì)時的副產(chǎn)物[14]，由于不同的酵母有著不同的理化特性，因此在相同條件下兩株酵母產(chǎn)生的芳香醇也存在著一定的差異。如圖3所示，兩株酵母在前酵過程中芳香醇隨著發(fā)酵時間的延長都有不同程度的提升，黃酒酵母HJ在黃酒發(fā)酵過程中3種芳香醇的含量均高于模式菌BY4743，前酵結(jié)束時，黃酒酵母HJ中β-苯乙醇、酪醇以及色醇的含量分別為100.71 mg/L、66.24 mg/L、2.05 mg/L，總芳香醇含量相比模式菌BY4743提高了20%。在后酵期間，兩株酵母的發(fā)酵體系中芳香醇的含量均有所下降，RODMAN等[24]認為，當(dāng)發(fā)酵溫度低于30 ℃時，溫度越高，發(fā)酵速度越快，因此后酵溫度(16 ℃)不利于酵母的生長代謝，使酵母無法正常利用氨基酸來合成芳香醇，并且芳香醇具有一定的揮發(fā)性，由此導(dǎo)致了發(fā)酵中后期黃酒發(fā)酵醪中芳香醇含量的降低。

由2.2可知，相比較于模式菌BY4743，黃酒酵母HJ具有更高的氨基酸釋放率和利用能力，這也使得黃酒酵母HJ總芳香醇含量比模式菌BY4743提高了20 %，說明除了選用不同品種的釀酒酵母來控制芳香醇之外，黃酒發(fā)酵過程中原料氨基酸的釋放也是控制芳香醇濃度的重要切入點。

2.4 發(fā)酵過程中理化指標的相關(guān)性分析

本文對發(fā)酵過程中的指標進行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)以pearson相關(guān)系數(shù)為基礎(chǔ)。前酵如圖4所示。可以發(fā)現(xiàn)黃酒酵母HJ前酵過程中酒精度與酸度（r=0.9）、氨基態(tài)氮（r=0.76）、苯乙醇（r=0.92）、酪醇（r=0.99）和色醇（r=0.86）呈極強的正相關(guān)，這些物質(zhì)均是釀酒酵母發(fā)酵過程中正常的代謝產(chǎn)物[29]，分析可知其產(chǎn)量有一定的相關(guān)性。黃酒酵母HJ發(fā)酵液中苯丙氨酸、酪氨酸與對應(yīng)的β-苯乙醇（r=0.8）、酪醇（r=0.77）之間存在著強相關(guān)性，但是色氨酸與色醇的相關(guān)系數(shù)（r=0.09）并不高，由2.3可知，色醇在發(fā)酵前48 h的增長是很緩慢的，在發(fā)酵72 h才開始快速增長，從而導(dǎo)致了兩者的相關(guān)性并不高。

由圖5可知，后酵期間黃酒酵母HJ與模式菌BY4743發(fā)酵體系中芳香族氨基酸和芳香醇的含量均呈負相關(guān)。其中黃酒酵母HJ后酵過程中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸與β-苯乙醇、酪醇和色醇的相關(guān)系數(shù)分別為-0.42、-0.9和-0.92，這是由于后酵期間酵母大量死亡，體內(nèi)的氨基酸釋放到發(fā)酵液中，使得游離氨基酸的含量大量升高[25]，而芳香醇的合成需要完整的細胞結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致了后酵期間芳香族氨基酸和芳香醇的含量呈一定的負相關(guān)。

2.5 酸性蛋白酶活的變化

由表3可知，在發(fā)酵第24 h和120 h時黃酒酵母HJ發(fā)酵醪中的酸性蛋白酶活均顯著高于BY4743（P＜0.05），分別為3.39 U/g和13.33 U/g，是BY4743的2.04倍和3.11倍。由于酸性蛋白酶具有超強的蛋白質(zhì)內(nèi)切和外切酶活力，可使自由氨基氮快速釋放[28]，因此較高的酸性蛋白酶活是黃酒酵母HJ芳香族游離氨基酸釋放率高于BY4743的主要原因之一，可以通過控制黃酒發(fā)酵過程中酸性蛋白酶的含量以及酶活的高低來控制原料中游離氨基酸的釋放，從而控制黃酒中芳香醇的含量。

表3 發(fā)酵醪中酸性蛋白酶酶活變化

3 結(jié)論

芳香醇是影響黃酒及料酒香氣的重要化合物，其濃度對產(chǎn)品品質(zhì)影響較大。探究黃酒酵母產(chǎn)芳香醇的差異及影響因素，為黃酒中芳香醇的調(diào)控提供重要的理論基礎(chǔ)。本文通過對比分析添加不同釀酒酵母（黃酒酵母HJ和模式菌株BY4743）的黃酒發(fā)酵過程中理化指標，芳香醇和氨基酸的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在前酵過程中，芳香族氨基酸的釋放與芳香醇的含量呈正相關(guān)。黃酒發(fā)酵結(jié)束時，HJ發(fā)酵醪中芳香族游離氨基酸的釋放率達25.16 %，是BY4743的2.34倍，其中有45.32%的芳香族游離氨基酸被HJ用于自身代謝與芳香醇的合成，較高的氨基酸釋放率和利用率也使得HJ芳香醇含量比BY4743提高1.26倍。在發(fā)酵第120 h時，HJ的蛋白酶活力是BY4743的3.11倍，結(jié)果表明，較高的蛋白酶活力使得黃酒酵母HJ有更強的芳香族游離氨基酸釋放率和利用率，從而促進了芳香醇的合成。這也說明在黃酒發(fā)酵過程中除了選擇優(yōu)質(zhì)的酵母來控制芳香醇含量外，也可以通過控制蛋白酶活力的高低來控制氨基酸的釋放，從而達到控制芳香醇含量的目的，這對黃酒中芳香醇的調(diào)控具有重要的指導(dǎo)作用。