王丹，劉曉娟，康天

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic Reticulum，ER）參與調(diào)控多種細(xì)胞功能，包括蛋白質(zhì)折疊、翻譯后修飾（PTMs）、脂肪酸生物合成、解毒，細(xì)胞內(nèi)鈣離子儲(chǔ)存等［1］。細(xì)胞內(nèi)的分泌蛋白和跨膜蛋白主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成［2］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)折疊、二硫鍵的形成、N-糖基化和許多其他PTMs1對(duì)新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行加工和修飾，而且它還與葡萄糖、脂類(lèi)和膽固醇代謝等過(guò)程有關(guān)［3-5］。在ER中，蛋白質(zhì)在伴侶蛋白和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶的幫助下，精確地折疊成天然構(gòu)象。然而，當(dāng)細(xì)胞受到各種內(nèi)外因素的刺激，如病毒感染、炎癥以及其他細(xì)胞水平的異常等，使ER蛋白質(zhì)的折疊功能異常，導(dǎo)致ER內(nèi)未折疊蛋白的積累，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic ReticulumStress，ERS）［6-8］。然而，細(xì)胞已經(jīng)發(fā)展出一種機(jī)制來(lái)感知這些變化，并通過(guò)特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活來(lái)重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，稱為未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded Protein Response，UPR）［9-10］。

UPR 信號(hào)通路可通過(guò)誘導(dǎo)折疊酶、伴侶蛋白、氧化還原酶的轉(zhuǎn)錄，減少蛋白質(zhì)翻譯，通過(guò)ER相關(guān)蛋白降解途徑（ERAD）降解未折疊蛋白來(lái)恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)［11］。然而，當(dāng)ERS 持續(xù)進(jìn)行時(shí)，UPR 從存活轉(zhuǎn)化為死亡誘導(dǎo)通路，將受影響的細(xì)胞清除出系統(tǒng)，而無(wú)限制的凋亡會(huì)導(dǎo)致器官細(xì)胞的丟失［12-13］。促凋亡信號(hào)通路使活性氧和促凋亡蛋白增加，激活炎癥分子，導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生［14］。ER 環(huán)境的紊亂還會(huì)導(dǎo)致許多蛋白的PTM異常，PTM可以通過(guò)生成新抗原激活自身免疫反應(yīng)［15］。一些ER蛋白，如胰島素，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78，谷氨酸脫羧酶65 等因PTM異常而轉(zhuǎn)化為新抗原［14，16］，這些新抗原激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞，產(chǎn)生病理狀態(tài)［17］。此外，在大鼠胰島素瘤細(xì)胞和非肥胖糖尿病小鼠中，細(xì)胞因子誘導(dǎo)ER應(yīng)激產(chǎn)生翻譯后修飾的免疫球蛋白結(jié)合蛋白（BIP）［18-19］，BIP導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細(xì)胞產(chǎn)生并分泌較高水平的白細(xì)胞介素17（IL-17）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和γ干擾素（IFN-γ）［20］。此外，ER應(yīng)激介導(dǎo)的UPR使重要的促炎細(xì)胞因子上調(diào)，使組織進(jìn)一步損傷［21］，在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用［22-23］。有趣的是，細(xì)胞因子在反饋回路機(jī)制中可以通過(guò)UPR 誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡［24］。綜上所述，ERS對(duì)自身免疫性疾病的發(fā)展有一定的作用。

兒童自身免疫性腦炎是由自身免疫功能異常而引發(fā)的免疫性疾病，其形式是自身抗體和T細(xì)胞攻擊宿主的身體［25-26］。大多數(shù)自身免疫性疾病通常以自身抗體、促炎細(xì)胞因子和自身反應(yīng)性T細(xì)胞的表達(dá)為特征［27-28］。許多環(huán)境因素，包括微生物感染、化學(xué)物質(zhì)暴露、自由基和炎癥等，都是已知的觸發(fā)自身炎癥的因素［29-32］，所有這些因素均可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，提示ERS可能與自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)。淋巴細(xì)胞凋亡的失調(diào)使免疫功能發(fā)生障礙，如免疫缺陷和自身免疫。有研究表明，UPR信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP-）同源蛋白（CHOP）在細(xì)胞凋亡中起重要作用［33-34］。因此，本研究旨在探討ERS 對(duì)AE 病人T 淋巴細(xì)胞存活和凋亡的影響以及UPR信號(hào)通路在AE淋巴細(xì)胞存活和死亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般材料試劑：RPMI 1640 培養(yǎng)基；胎牛血清（美國(guó)Gibco-BRL 公司）；青霉素（美國(guó)Sigma 公司）；鏈霉素（美國(guó)Sigma 公司）；RIPA 細(xì)胞裂解液（上海碧云天生物公司）；蛋白酶抑制劑cocktail（美國(guó)Roche 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；Annexin-V-PE Kit（美國(guó) BD 公司）；PI（美國(guó)BD 公司）；TG（美國(guó)Sigma 公司）；Cell Counting Kit-8（日本同仁化學(xué)研究所）；Ficoll-Paque Plus（通用電氣醫(yī)療集團(tuán)）。抗體：BIP（CST，3177）；CHOP（CST，2895）；B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2），B 淋巴細(xì)胞瘤-XL（Bcl-XL），bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）（Santa Cruz）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（proteintech，10494-I-AP）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記鼠二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；HRP羊抗兔IgG（康為世紀(jì)，cw0103）。所有研究對(duì)象或其近親屬簽署知情同意書(shū)，本項(xiàng)研究所用方法符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》，且經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)后實(shí)施（倫理批號(hào)20170218），研究時(shí)間為2017 年2月至2019年2月。

1.2 方法

1.2.1外周血單核細(xì)胞分離和T淋巴細(xì)胞分選 在提供知情同意后，從石家莊市第一醫(yī)院兒科AE病人和年齡、性別匹配的健康供者處獲得30～40 mL的外周血樣本。外周血樣本用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（pH 7.4）1∶2 稀釋后置于淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-Paque Plus）上，20 ℃離心30 min；從Ficoll-Paque與血清層間收集PBMCs，PBS洗滌2次。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分選。采用鏈霉親和素結(jié)合的CD11b/巨噬細(xì)胞抗原、人源化抗人（CD16）、B淋巴細(xì)胞抗原（CD19）、血小板反應(yīng)蛋白受體（CD36）、巨核細(xì)胞糖蛋白IIb/IIIa（CD41a）、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（CD56）和血紅糖蛋白A（CD235a）生物素化抗體復(fù)合物對(duì)外周血單核細(xì)胞進(jìn)行負(fù)性分選，分離T細(xì)胞。即PBMCs 與加入蛋白酶抑制劑的抗體在室溫下孵育15 min，磁珠與單抗在室溫下孵育30 min。采用磁板純化T 細(xì)胞，純度大于99%，采用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)T淋巴細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 分選出的T淋巴細(xì)胞用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞生存能力分析 將AE 病人和健康供者的T 淋巴細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種1×104個(gè)T淋巴細(xì)胞，每個(gè)樣本接種6個(gè)復(fù)孔，用不同濃度的TG（0、0.5、1、5、10 nM）處理AE 病人和健康供者的T 細(xì)胞，48 h后分別在每孔加入CCK8溶液（每孔10μL），將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)60 min。利用酶標(biāo)儀在450 nm處通過(guò)吸光度值測(cè)量計(jì)數(shù)活細(xì)胞。

1.2.4Annexin V 和PI 染色進(jìn)行凋亡分析 采用Annexin V/PI染色定量檢測(cè)細(xì)胞膜胞外側(cè)磷脂酰絲氨酸的含量。AE 病人和健康供者的T 淋巴細(xì)胞種于6 cm皿，待細(xì)胞密度約為70%時(shí)，TG（5 nM）處理48 h。收集細(xì)胞：用胰酶消化細(xì)胞，800 r/min 離心5 min，棄上清，由預(yù)冷的PBS 洗滌后，收集細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞（TG 未處理的AE 病人和健康供者的T 淋巴細(xì)胞）和TG 處理細(xì)胞在室溫下按照試劑說(shuō)明書(shū)用Annexin V-FITC（5 μL）和 PI（10 μg/mL）染色 10 min，用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析。

1.2.5細(xì)胞樣品蛋白質(zhì)提取 將分選的AE 病人和健康供者的T淋巴細(xì)胞接種于6 cm皿，待細(xì)胞密度約為70%時(shí)，TG（5 nM）處理細(xì)胞，48 h后用PBS洗滌細(xì)胞并收集細(xì)胞。將加有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液加入收集的細(xì)胞，在冰上裂解15 min后，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，4 ℃，12 000 r/min離心15 min。離心后吸取上清液，并用蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行定量。定量后每組樣品中加入1/4體積的5×Loading Buffer緩沖液，沸水煮沸5 min后-20 ℃保存。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法（Western blot） 根據(jù)BCA 配膠試劑盒說(shuō)明書(shū)，配制10%的平板凝膠。每組蛋白樣品取30 μg 進(jìn)行凝膠電泳（恒壓120 V，2 h），甲醇激活PVDF 膜后轉(zhuǎn)膜（恒壓100 V，2 h），轉(zhuǎn)膜結(jié)束后在封閉緩沖液（5%脫脂牛奶）中室溫孵育60 min，TBST洗滌后一抗室溫孵育1 h后4 ℃過(guò)夜孵育。一抗孵育后取出PVDF膜，TBST洗3次，每次7 min，洗滌后二抗室溫孵育60 min，TBST洗3次，每次7 min，用ECL法檢測(cè)反應(yīng)蛋白。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0進(jìn)行本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。觀測(cè)資料主要是計(jì)量數(shù)據(jù)，以±s表示，以單因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey多重比較試驗(yàn)對(duì)多組進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)T淋巴細(xì)胞存活的影響用不同濃度的TG（0、0.5、1、5、10 nM）處理AE病人和健康供者外周血T淋巴細(xì)胞48 h，使用CCK-8試劑盒檢測(cè)AE病人和健康供者外周血T淋巴細(xì)胞的生存能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示，不同濃度TG（0、0.5、1、5、10 nM）處理48 h后AE病人T細(xì)胞存活率分別為（9.92±0.42）%、（9.11±0.41）%、（7.06±0.39）%、（6.07±0.31）%、（5.02±0.30）%；健康供者T 細(xì)胞存活率分別為（10.46±0.47）%、（10.05 ± 0.49）% 、（9.91 ± 0.41）% 、（9.85 ±0.42）%、（9.77±0.41）%、兩組均呈劑量依賴性下降。與健康供體相比，AE病人T淋巴細(xì)胞在TG處理后T細(xì)胞存活率下降更為顯著，AE病人和健康供者外周血T淋巴細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明TG可明顯抑制AE病人T淋巴細(xì)胞的生存能力。

2.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)T 淋巴細(xì)胞凋亡的影響用ERS誘導(dǎo)劑TG（5 nM）分別處理AE病人和健康供者外周血T淋巴細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，并進(jìn)行AnnexinV和PI雙染，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡情況。檢測(cè)結(jié)果顯示（圖1），與健康供者相比，AE病人T細(xì)胞（15.65±1.11）%在體外比對(duì)照組（6.11±0.65）%更容易凋亡。此外，我們發(fā)現(xiàn)TG誘導(dǎo)AE病人和健康供者外周血T 淋巴細(xì)胞后，AE 病人的T 淋巴細(xì)胞（19.65±1.55）%凋亡水平明顯高于健康供者（10.89±1.03）% 和 未 進(jìn) 行 TG 誘 導(dǎo) 的 AE 病 人（15.65±1.11）%，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明TG 刺激可促進(jìn)AE病人的T淋巴細(xì)胞凋亡。

圖1 TG誘導(dǎo)可促進(jìn)自身免疫性腦炎（AE）病人的T淋巴細(xì)胞凋亡

2.3 TG 誘導(dǎo)后T 淋巴細(xì)胞UPR 相關(guān)蛋白的表達(dá)將AE 病人外周血淋巴細(xì)胞（PBMCs）和健康供體中分離的T淋巴細(xì)胞，分別用TG（5 nM）處理這兩種細(xì)胞，48h 后收集細(xì)胞并提取蛋白。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)UPR 標(biāo)志分子BIP（UPR 的中心調(diào)節(jié)因子）和CHOP（抑制Bcl-2基因啟動(dòng)子）的蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示：與健康供體UPR 標(biāo)志分子BIP 和CHOP 的蛋白表達(dá)水平（0.50±0.05、0.53±0.06）%相比，AE病人外周血T淋巴細(xì)胞BIP（0.23±0.04）%的表達(dá)降低，而CHOP（0.81±0.07）%的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.329、7.439，P＜0.01）。以上結(jié)果提示，BIP和CHOP可能介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的外周血T淋巴細(xì)胞凋亡。

圖2 毒胡蘿卜素（TG）誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4 TG 誘導(dǎo)后T 淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡受抗凋亡和促凋亡信號(hào)調(diào)控，包括Bcl-2、Bcl-XL、Bax。分別用TG（5nM）處理從AE 病人外周血淋巴細(xì)胞（PBMCs）和健康供體中分離T 淋巴細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞并提取蛋白。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bcl-XL 和Bax 的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示：與健康供體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bcl-XL 和Bax 的表達(dá)水平［（1.41±0.04）%、（1.23±0.06）%、（0.51±0.01）%］相比，AE 病人的 T 細(xì)胞中抗凋亡蛋白 Bcl-2（0.73±0.07）%和Bcl-XL（0.51±0.05）%表達(dá)水平降低，而促凋亡蛋白Bax（1.25±0.05）%表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=35.548、20.660、22.581，P＜0.01）。以上結(jié)果表明BIP和CHOP可能通過(guò)抗凋亡信號(hào)和促凋亡信號(hào)介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的外周血T淋巴細(xì)胞凋亡。

圖3 毒胡蘿卜素（TG）誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

AE的T細(xì)胞在其發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用，而T淋巴細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡失調(diào)是AE最重要的發(fā)病機(jī)制之一。我們的研究證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可明顯抑制AE病人T淋巴細(xì)胞的生存能力，促進(jìn)AE病人T淋巴細(xì)胞凋亡。因此，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能成為AE治療的一個(gè)有價(jià)值的藥理靶點(diǎn)。UPR在許多類(lèi)型的免疫細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用［35］。由于免疫細(xì)胞的分泌功能，其具有較多的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并且具有較高的蛋白質(zhì)折疊活性，因此它們更容易受到毒素、疾病和病原體等誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因素的影響［36］。UPR在免疫功能中的作用可能是多種復(fù)雜免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制之一［37］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，AE病人外周血T淋巴細(xì)胞CHOP的表達(dá)顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表達(dá)水平降低，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加。這一結(jié)果證實(shí)UPR通路與AE的發(fā)生有關(guān)，同時(shí)可能通過(guò)調(diào)控抗凋亡信號(hào)和促凋亡信號(hào)介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的外周血T淋巴細(xì)胞凋亡。

BIP是ER應(yīng)激反應(yīng)的中心調(diào)控因子，各種應(yīng)激因素可以誘導(dǎo)BIP的表達(dá)，它通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡和增殖來(lái)維持T細(xì)胞的存活［38］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)T細(xì)胞存活的調(diào)控與CHOP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)有關(guān)，CHOP蛋白表達(dá)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［33，39］。在本研究中，我們檢測(cè)了TG刺激后AE病人T細(xì)胞BIP和CHOP蛋白的表達(dá)水平，與健康供者相比，AE病人外周血T淋巴細(xì)胞BIP的表達(dá)水平降低，CHOP的表達(dá)水平顯著升高。此外，與健康供體相比，TG誘導(dǎo)后AE病人的T細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表達(dá)水平降低，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加。AE病人BIP反應(yīng)可能導(dǎo)致ER應(yīng)激時(shí)T細(xì)胞凋亡反應(yīng)水平升高，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞減少。然而，BIP在T細(xì)胞活化、分化、增殖和存活中的確切作用尚不清楚。因此，確定細(xì)胞內(nèi)BIP在T細(xì)胞病理生理和T細(xì)胞依賴性自身免疫性疾?。ㄈ鏏E）發(fā)展中的作用，可能有助于開(kāi)發(fā)診斷標(biāo)記物或治療靶點(diǎn)。